地黃提取物對高尿酸血癥小鼠的影響

劉 靜，劉 梅，楊 波，馬 靜，魯 毅，邱 彥

（解放軍454醫院藥劑科，江蘇 南京 210002）

地黃提取物對高尿酸血癥小鼠的影響

劉 靜，劉 梅，楊 波，馬 靜，魯 毅，邱 彥

（解放軍454醫院藥劑科，江蘇 南京 210002）

目的：觀察地黃提取物對高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響，初步探討其可能的作用機理。方法：采用氧嗪酸鉀腹腔注射誘導高尿酸血癥小鼠模型，將成模小鼠隨機分為模型組、地黃提取物低（2 g·kg-1）、中（4 g·kg-1）、高（8 g·kg-1）劑量組和別嘌醇（20 mg·kg-1）組。對小鼠血清尿酸、肌酐、一氧化氮，肝臟黃嘌呤氧化酶（XOD）和腺苷脫氨酶（ADA）等指標進行觀察分析，并對小鼠腎臟進行病理檢查。結果：給藥干預14 d后，與模型組比較，地黃提取物中、高劑量組均可顯著降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸、肌酐含量（P ＜ 0.01），顯著升高一氧化氮水平（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01），并可顯著抑制高尿酸血癥小鼠肝臟XOD活性（P ＜ 0.01）。地黃提取物高劑量組對高尿酸血癥小鼠肝臟ADA活性有顯著的抑制作用（P ＜ 0.05）。病理檢查結果顯示，地黃提取物三個劑量組的腎臟組織病變程度要明顯輕于模型組。結論：地黃提取物對高尿酸血癥小鼠具有降低血清尿酸水平作用，其機制與抑制肝臟XOD和ADA活性有關。

地黃提取物；高尿酸血癥；尿酸；黃嘌呤氧化酶；腺苷脫氨酶；小鼠

高尿酸血癥又稱為痛風，是一種嘌呤代謝異常及紊亂所致的疾病，其臨床特點為高尿酸血癥及由此引起的痛風性關節炎反復發作、痛風石沉積，痛風石性慢性關節炎及關節畸形，常累及腎臟而引起慢性間質性腎炎和形成尿酸結石。高尿酸血癥已成為一種常見疾病，與肥胖癥、高脂血癥、高血壓、糖尿病、動脈硬化、冠心病、尿路感染、腎功能衰竭等發病密切相關[1]，嚴重危害人類健康，并且近年來其發病率在全球大部分地區及我國均逐年上升[2]。因此，對高尿酸及痛風的防治研究日益重要。

地黃含梓醇、小檗堿、藥根堿、木蘭花堿、地黃堿等有效成分，其作為中藥使用已有上千年歷史，主要功效為降血糖、止血、強心、利尿、抗炎免疫和保肝等。本實驗采用氧嗪酸鉀鹽誘導急性高尿酸血癥小鼠模型，觀察地黃提取物對高尿酸血癥小鼠血清尿酸、肌酐、一氧化氮水平以及肝臟黃嘌呤氧化酶（XOD）與腺苷脫氨酶（ADA）活性的影響，以期為其治療高尿酸血癥和痛風藥開發提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物

ICR小鼠，雄性，60只，18 ～ 20 g，SPF級，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2013-0016。在室溫22 ～ 26 ℃、濕度40% ～ 70%的動物房內飼養，光照時間隨自然變化，自由飲食飲水。動物適應性飼養1周后進行實驗。

1.2 藥品及試劑

地黃提取物（梓醇含量≥94.8%，常州千杏生物科技有限公司）；別嘌醇片（上海信誼萬象藥業股份有限公司，規格：0.1 g，批號130301）；氧嗪酸鉀（上海源葉生物科技有限公司，批號SF0328GD13）。考馬斯亮藍蛋白測試盒（批號20141115）、黃嘌呤氧化酶測定試劑盒（批號20141026）、腺苷脫氨酶測定試劑盒（批號20140717）、尿酸測定試劑盒（批號20140606）、肌酐（批號20140717）、一氧化氮（批號20140717）均為南京建成生物工程研究所產品。

1.3 實驗儀器

BTS-370plus型全自動生化分析儀（西班牙BioSystems公司）；TDL-80-2B低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；梅特勒AL140電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Thermo Multiskan MK3全自動酶標儀（美國Thermo Scientific公司）；DY89-Ⅰ電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Leica RM2135滑動切片機（德國Leica公司）；Olympus DM750光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥

軻左手把秦王袖，右手揕其胸，數之曰：“足下負燕日久，貪暴海內，不知厭足。于期無罪而夷其族。軻將海內報仇。今燕王母病，與軻促期。從吾計則生，不從則死。”秦王曰：“今日之事，從子計耳!乞聽琴聲而死。”召姬人鼓琴，琴聲曰：“羅縠單衣，可掣而絕。八尺屏風，可超而越。鹿盧之劍，可負而拔。”軻不解音。秦王從琴聲負劍拔之，于是奮袖超屏風而走。軻拔匕首擿之，決秦王，刃入銅柱，火出。秦王還斷軻兩手。軻因倚柱而笑，箕踞而罵曰：“吾坐輕易，為豎子所欺。燕國之不報，我事之不立哉！”

將60只小鼠隨機分為6組，每組10只。分別為空白對照組、模型（高尿酸血癥）組、陽性藥別嘌醇（20 mg·kg-1）組、地黃提取物低劑量（2 g·kg-1）組、中劑量（4 g·kg-1）組和高劑量（8 g·kg-1）組，給藥體積為0.2 mL·10 g-1小鼠體重。空白對照和模型組灌胃給予等體積的0.9%氯化鈉注射液，連續灌胃給藥14 d，每天1次，末次于造模1 h后給藥。

2.2 高尿酸血癥小鼠模型的建立[3-4]

選用氧嗪酸鉀鹽為化學誘導劑，抑制尿酸酶活性，抑制小鼠體內尿酸分解，增高血清尿酸水平，造成高尿酸血癥小鼠模型。于末次給藥前1 h，小鼠腹腔注射300 mg·kg-1氧嗪酸鉀鹽，空白對照組腹腔注射相應體積0.9%氯化鈉注射液。

2.3 指標檢測

2.3.1血清尿酸、肌酐和一氧化氮水平檢測 末次給藥1 h后，小鼠摘眼球后取血，全血3000 r·min-1，離心10 min，取血清置于4 ℃冰箱中，待測尿酸、肌酐、一氧化氮含量。參照試劑盒方法操作進行尿酸、肌酐、一氧化氮含量的檢測。

2.3.2肝臟XOD及ADA活性測定 放血處死小鼠后，快速取肝臟組織塊，立即投入液氮中速凍，取出后置于– 80 ℃冰箱中保存，待測肝臟XOD及ADA活性。肝臟組織塊稱重后，按重量體積比加入9倍量預冷的0.9%氯化鈉注射液制成10%組織勻漿液，2500 r·min-1離心10 min，取上清按照試劑盒方法測定組織勻漿液蛋白含量、XOD和ADA活性。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 地黃提取物對高尿酸血癥小鼠的尿酸、肌酐和一氧化氮水平的影響

與空白對照組比較，模型組高尿酸血癥小鼠的尿酸、肌酐含量顯著升高，一氧化氮水平顯著降低，差異均具有統計學意義（P ＜ 0.05），說明高尿酸血癥小鼠模型造模成功。與模型組相比，地黃提取物中、高劑量組和別嘌醇組均可不同程度抑制氧嗪酸鉀鹽引起的高尿酸血癥小鼠的尿酸和肌酐水平的升高（P ＜ 0.01），同時升高高尿酸血癥小鼠一氧化氮的水平（P ＜ 0.05）。詳見表1。

表1 地黃提取物對高尿酸血癥小鼠的尿酸、肌酐和一氧化氮水平的影響.Tab 1 Effect of Radix Rehmanniae extract on the level of serum uric acid, creatinine, nitric oxide in hyperuricemia mice. n =

表1 地黃提取物對高尿酸血癥小鼠的尿酸、肌酐和一氧化氮水平的影響.Tab 1 Effect of Radix Rehmanniae extract on the level of serum uric acid, creatinine, nitric oxide in hyperuricemia mice. n =

注：與空白對照組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01；與模型組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01Note: compared with blank control group,#P ＜ 0.05,##P ＜ 0.01; compared with model group,*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01

3.2 地黃提取物對高尿酸血癥小鼠的肝臟XOD及ADA活性的影響

由表2可知，與空白對照組比較，模型組高尿酸血癥小鼠肝臟XOD及ADA活性都顯著性升高（P ＜0.01），說明高尿酸血癥小鼠造模成功。與模型組相比，地黃提取物中劑量組顯著降低高尿酸血癥小鼠肝臟XOD活性（P ＜ 0.01）。與模型組比較，地黃提取物高劑量組均可顯著降低高尿酸血癥小鼠肝臟XOD及ADA的活性，差異具有統計學意義（P ＜ 0.05）。

表2 地黃提取物對高尿酸血癥小鼠的肝臟XOD及ADA活性的影響.Tab 2 Effect of Radix Rehmanniae extract on hepatic XOD and ADA activities in hyperuricemia mice.

表2 地黃提取物對高尿酸血癥小鼠的肝臟XOD及ADA活性的影響.Tab 2 Effect of Radix Rehmanniae extract on hepatic XOD and ADA activities in hyperuricemia mice.

注：與空白對照組比較，##P ＜ 0.01；與模型組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01 Note: compared with blank control group,##P ＜ 0.01; compared with model group,*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01

3.3 地黃提取物對高尿酸血癥小鼠腎臟組織形態學的影響

病理結果顯示，空白對照組：腎臟結構正常，腎小管無混濁腫脹，腎小球大小正常。模型組：腎小管紊亂，腎小球出血嚴重，小球周圍有大量炎性細胞浸潤。別嘌醇組：腎小管排列較為整齊，出血較少。地黃提取物低劑量組：腎小管排列趨于均勻化，炎性細胞少。地黃提取物中劑量組：腎小球排列較為均勻，炎性細胞較少，腎小管無明顯出血。地黃提取物高劑量組：腎小管排列整齊，出血較少，炎性細胞浸潤很少，腎小球結構相對完整。病理結果顯示，地黃提取物三個劑量組的病變程度明顯輕于模型組。詳見圖1。

圖1 地黃提取物對高尿酸血癥小鼠腎臟組織形態學的影響A – 空白對照組，B – 模型組，C – 別嘌醇組，D – 低劑量組，E –中劑量組，F – 高劑量組Fig 1 Effect of Radix Rehmanniae extract on the histomorphology of kidney in hyperuricemia miceA – blank control group, B – model group, C – allopurinol group, D –low dose group, E – middle dose group, F – high dose group

4 討論

本研究采用尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀鹽為化學誘導劑，抑制小鼠體內尿酸分解造成小鼠高尿酸血癥模型，方法簡便、靈敏度高、重復性好，該方法建模已經普遍用于抗高尿酸血癥和痛風作用的藥物評價[6]及其機制研究。

高尿酸血癥導致機體尿酸水平升高，易引起腎功能損傷[7]，使得肌酐排泄障礙，從而引起機體肌酐水平的升高。研究報道[8-9]高尿酸血癥可升高血清ET-1水平和降低NO水平，造成血管內皮功能障礙。XOD活性直接調控體內尿酸水平的高低，XOD和ADA活性的升高會促進核酸的分解代謝，導致尿酸生成量增加[10]。本實驗結果顯示，地黃提取物可顯著降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸和肌酐水平，具有明顯的抗高尿酸血癥效果，提示其對腎功能有保護作用。地黃提取物對高尿酸血癥小鼠血清中NO含量有顯著升高，說明其對血管內皮有一定的保護作用。地黃提取物能有效降低高尿酸血癥小鼠肝臟的XOD和ADA活性，表明地黃提取物通過抑制XOD和ADA活性來減少尿酸的生成，降低血尿酸水平，從而達到改善高尿酸血癥的效果。

地黃為補腎陰之主藥，具有滋陰補腎的功效，臨床應用作為補氣養陰藥治療氣陰兩虛型腎炎和早期腎衰竭，對降低蛋白尿和改善腎功能均有療效[11]。本實驗結果顯示，地黃提取物可明顯改善高尿酸血癥小鼠腎組織的病理變化，對高尿酸血癥所致腎臟損傷有一定的保護作用。

地黃具有重要的臨床應用價值，其藥理作用廣泛，對免疫、血液、內分泌、心腦血管及神經系統等方面均有一定的作用。梓醇是地黃的主要有效活性成分，其為小分子化合物，水溶性好，口服易吸收[12]。現代研究表明，梓醇具有抗炎[13]、止痛、神經保護[14]、抗腫瘤、降血糖[15]等作用。我國應用地黃的歷史悠久，并積累了豐富的用藥經驗，其藥用不良反應及毒副作用甚小，可長期服用，較安全可靠。實驗研究表明，地黃提取物具有抗高尿酸血癥作用，其藥材資源豐富。因此，對地黃提取物在抗高尿酸血癥和痛風方面的藥用深入開發，有著極為廣闊的應用前景。

[1] 郭麗萍，王睿.高尿酸血癥的流行病學特點和藥物應用[J].中國藥物應用與監測，2006，3（4）：24-27.

[2] 梁曉萍，梁瓊麟，胡坪，等.高尿酸血癥與痛風研究進展[J].中國藥理學通報，2008，24（10）：1265-1268.

[3] 曾金祥，畢瑩，魏娟，等.車前草提取物降低急性高尿酸血癥小鼠血尿酸水平及機理研究[J].時珍國醫國藥，2013，24（9）：2064-2066.

[4] 王友蘭，鄒雁寧.高尿酸血癥小鼠模型的復制與應用體會[J].實驗動物科學，2012，29（4）：37-39.

[5] 陳瞳，崔凌凌，王希波，等.高尿酸血癥大鼠模型的建立及其腎臟損傷觀察[J].山東醫藥，2013，53（43）：29-31.

[6] 鐘舒紅，何家康，胡庭俊，等.復方腫節風顆粒對小鼠急性高尿酸血癥的影響[J].湖北農業科學，2014，53（4）：860-862，876.

[7] 雷三霞，于長國，曾春艷.高尿酸血癥與腎損害相關性研究進展[J].醫學綜述，2014，20（10）：1775-1777.

[8] 柳高，朱平.復方丹參滴丸降低尿酸和內皮保護作用動物實驗研究[J].解放軍醫學院學報，2013，34（4）：399-401，404.

[9] 石金鑫，董靜，朱平.B族維生素在雄性小鼠高尿酸血癥中的作用[J].中國心血管雜志，2013，18（2）：121-124.

[10] 姚芳芳，張銳，傅瑞娟，等.槲皮素對高尿酸血癥大鼠黃嘌呤氧化酶和腺苷脫氨酶活性的影響[J].鄭州大學學報（醫學版），2011，46（2）：248-251.

[11] 李慧芬.地黃藥理作用和臨床應用概況[J].藥學研究，2014，33（6）：345-347.

[12] 董炤，陳長勛.梓醇藥理作用的研究進展[J].中成藥，2013，35（5）：1047-1051.

[13] 王根發，董競成.若干補益中藥之組分抗炎作用研究概述[J].中華中醫藥學刊，2013，31（8）：1598-1600.

[14] 張秀杰，尹安春，劉晶.中西醫結合角度談地黃活性成分梓醇的神經保護作用及治療前景[J].遼寧中醫雜志，2013，40（6）：1273-1276.

[15] 劉江月.梓醇對糖尿病大鼠主動脈的保護作用與抗氧化機制研究[J].中國病理生理雜志，2014，30（6）：1023-1028.

Effect of Radix Rehmanniae extract on hyperuricemia mice

LIU Jing, LIU Mei, YANG Bo, MA Jing, LU Yi, QIU Yan
(Department of Pharmacy, the No. 454 Hospital of PLA, Nanjing 210002, China)

Objective:To observe the effect of Radix Rehmanniae extract on the level of serum uric acid in hyperuricemia mice and investigate the mechanism preliminarily.Methods:The intraperitoneal injection of uricase inhibition potassium oxonate was used to induce the hyperuricemia in mice. The mice were randomly divided into model group, Radix Rehmanniae extracts treatment groups (with the doses of 2, 4 and 8 g·kg-1) and the allopurinol positive control group (20 mg·kg-1). The serum levels of uric acid, creatinine, nitric oxide, and the levels of xanthine oxidase (XOD) and adenosine deaminase (ADA) in liver were observed, and the pathological changes in kidney of mice were detected.Results:After 14 days of drug intervention, compared with the model group, the Radix Rehmanniae extract middle and high dose groups reduced the levels of serum uric acid and creatinine (P ＜ 0.01), increased serum levels of nitric oxide (P ＜ 0.05, P ＜ 0.01), and significantly inhibited the liver XOD (P ＜ 0.01). It showed that Radix Rehmanniae extract high dose group significantly inhibited the ADA in hyperuricemia mice (P ＜ 0.05). The results of pathological examination showed that the pathological changes in kidney of all extracts groups were lower than that of the model group.Conclusion:The Radix Rehmanniae extract can reduce the level of serum uric acid in the model of hyperuricemia mice, and the effect is related to the inhibition of the activity of liver XOD and ADA.

Radix Rehmanniae extract; Hyperuricemia; Uric acid; Xanthine oxidase; Adenosine deaminase; Mice

R96

A

1672 – 8157(2015)06 – 0347 – 04

2015-04-12

2015-07-11）

南京軍區醫學科研基金資助項目（09Z014）

邱彥，男，博士，副主任藥師，主要從事臨床藥學工作。E-mail：qiuyan2189@163.com

劉靜，女，主管藥師，主要從事醫院藥學工作。E-mail：455379546@qq.com