瑣瑣葡萄多糖對β淀粉樣蛋白誘導PC12細胞凋亡的影響

瑣瑣葡萄多糖對β淀粉樣蛋白誘導PC12細胞凋亡的影響

袁芳徐琦盛磊劉濤1

(新疆醫科大學基礎醫學院，新疆烏魯木齊830011)

摘要〔〕目的探討瑣瑣葡萄多糖(VTP)對β淀粉樣蛋白(Aβ25～35)誘導PC12細胞凋亡的影響及作用機制。方法Aβ25～35誘導PC12細胞建立阿爾茨海默病(AD)細胞模型，VTP(20、40、80 mg/L)作用于細胞模型，CCK-8法檢測各組細胞活性，流式細胞術檢測細胞凋亡率，Real-time PCR檢測凋亡相關基因Bcl-2和Bax表達。結果VTP可提高PC12細胞活性，降低細胞凋亡率，增強Bcl-2 mRNA表達，抑制Bax mRNA表達。結論VTP對Aβ25～35誘導的PC12細胞凋亡具有明顯的保護作用，其機制可能是通過增強Bcl-2 mRNA表達、降低Bax mRNA表達，抑制細胞凋亡。

關鍵詞〔〕阿爾茨海默病；瑣瑣葡萄多糖；PC12細胞； Aβ25～35；細胞凋亡

中圖分類號〔〕R965.1〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學

通訊作者：劉濤(1974-)，女，博士，教授，主要從事食品毒理研究。

1新疆醫科大學公共衛生學院

第一作者：袁芳(1976-)，女，博士，副教授，主要從事維吾爾藥物的應用基礎研究。

The effects of polysaccharides from Vitis viniferal L on apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25～35

YUAN Fang,XU Qi,SHENG Lei,etal.

College of Basic Medicine,Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,Xinjiang,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate protective effects of polysaccharide from Vitis viniferal L(VTP) on apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25～35.MethodsAlzheimer's disease(AD) cellmodel was established by Aβ25～35 inducing PC12 cells,then,the cells were divided into control,model(20 μmol/L Aβ25～35) and VTP groups(20,40,80 mg/L).Cell viability was detected by CCK-8 method.The apoptotic rates were examined by Annexin V-FITC.The mRNA expressions of Bcl-2 and Bax were quantified by real-time PCR.ResultsCompared with that of model group,cell viability was improved,the apoptotic rate was reduced in VTP groups(P<0.05),while the expression of Bcl-2 was increased and Bax expression was decreased(P<0.05).ConclusionsVTP inhibits apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25～35,which might be involved adjust Bcl-2 and Bax gene expression in the mechanism of anti-apoptosis.

【Key words】Alzheimer's disease；VTP；PC12 cells；Aβ25～35；Apoptosis

隨著對阿爾茨海默病(AD)研究的深入，天然藥物預防和治療AD的作用日益受到重視。國內外研究顯示，葡萄提取物能預防老年癡呆，對原花青素、白藜蘆醇等葡萄提取物的抗癡呆作用報道較多〔1,2〕。瑣瑣葡萄(Vitis vinifera L)主產于新疆吐魯番、和田等地，是《神農本草經》《維吾爾藥志》等醫藥文獻記載的藥用葡萄品種。本課題組從瑣瑣葡萄提取了多糖、黃酮、三萜等活性物質，研究其抗突變、抗氧化、抗病毒、抗衰老等作用〔3〕。本研究擬探討瑣瑣葡萄多糖(VTP)抑制神經細胞凋亡的作用及機制。

1材料與方法

1.1藥品與試劑VTP按照專利方法(發明專利200710201354)提取分離，劉濤教授饋贈。DMEM培養液溶解，0.22 μm尼龍濾膜過濾除菌，-20℃避光保存，實驗時用完全培養液稀釋至所需濃度。Aβ25～35(Sigma公司，超純水溶解Aβ25～35，置于37℃老化7 d)；DMEM培養液(美國Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；CCK-8檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；Trizol(Invitrogen)；逆轉錄試劑盒(TaKaRa)，熒光定量試劑(Invitrogen)，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(BioVision)。

1.2儀器二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)，垂直流超凈化臺(美國Thermo公司)，全自動酶標儀(美國Bio-Rad公司)，流式細胞儀(BD LSRⅡ)，PCR擴增儀(Applied Biosystems)，Real Time PCR System 7700型(美國ABI公司)。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養PC12細胞(高分化)購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。細胞培養液DMEM高糖培養基，含10%滅活胎牛血清、105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素，置培養箱(37℃、5%CO2飽和濕度)，隔天換液，3～4 d傳代。

1.3.2CCK-8法測定細胞活性對數生長期的PC12細胞，5×104ml接種于96孔板，100 μl/孔。設對照組、模型組、VTP實驗組。培養至貼壁后，實驗組加入VTP，使其終濃度為20、40、80 mg/L。預處理4 h后，除對照組外，其余各孔加入Aβ25～35，使之終濃度為20 μmol/L。繼續培養24 h，每孔加入CCK-8 10 μl，繼續培養1 h。在酶標儀450 nm測定吸光度，計算PC12細胞存活率。每組設5個復孔，實驗重復3次。

1.3.3流式細胞儀檢測細胞凋亡按上述方法分組，培養細胞接種于6孔板，消化各組細胞后收集，1 000 r/min離心5 min，細胞沉淀用冷DMEM洗滌2次，在緩沖液中重懸成單細胞懸液，室溫下加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染料，輕輕振蕩、混勻，避光孵育15 min，流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.3.4Real-time PCR檢測Bcl-2和Bax基因表達按上述方法分組，6孔板培養細胞，Trizol法提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計分析RNA濃度和純度。逆轉錄合成cDNA。逆轉錄產物cDNA 加入熒光定量PCR反應體系。根據GenBank序列，引物和探針設計軟件Primer 5.0設計引物序列。引物序列β-actin：上游引物3′-AGACCTTCAACACCCCAGCC-5′，3′-CGTCAGGCAGCTCATAGCTC-5′，擴增長度362 bp；Bax：3′-CGGCGAATTGGAGATGAACTG-5′，3′-GCAAAGTAGAAGAGGGCA ACC-5′，擴增長度161 bp；Bcl-2：3′-GTCGCTACCGTCGTGACTT-5′，3′-CAGCCTCCGTTATCCTGGA-5′，擴增長度268 bp。經過Blast分析，引物序列具有特異性。所用的引物及內參照β-actin引物由鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。數據采用雙標準曲線法處理，計算待測組目的基因相對于對照組的表達差異倍數。

1.4統計學分析采用SPSS18.0軟件進行t檢驗。

2結果

2.1VTP對PC12細胞活性的影響與對照組比較，模型組細胞生長受到抑制，細胞活性下降(P<0.01)；VTP各實驗組與模型組比較，細胞活性明顯增加(P<0.05)，呈劑量相關性。見表1。

2.2VTP對細胞凋亡的影響對照組細胞凋亡率為4.58%，模型組細胞凋亡率(36.8%)明顯升高，加入VTP干預的各組細胞與模型組相比，細胞凋亡率下降，低、中、高劑量組凋亡率分別為17.05%、11.37%、8.96%。

2.3VTP對Bcl-2 mRNA表達的影響模型組與對照組相比，Bcl-2 mRNA表達下降(P<0.01)；VTP各劑量組與模型組相比，Bcl-2 mRNA表達升高(P<0.05)。見表1。

2.4VTP對Bax mRNA表達的影響模型組與正常組相比，Bax mRNA表達增加(P<0.01)；與模型組相比，VTP各劑量組Bax表達降低(P<0.01)。見表1。

表1　VTP對Aβ 25～35誘導的PC12細胞活性及

與對照組相比：1)P<0.01；與模型組相比：2)P<0.05，3)P<0.01

3討論

Aβ是老年斑的主要成分，AD發病的起始因素是大腦中Aβ的沉積和聚集，發病機制與Aβ的神經毒性作用密切相關〔4〕。在AD動物模型及細胞模型研究中，Aβ25～35誘導損傷建立AD模型是常用方法〔5，6〕。本研究采用20 μmol/L Aβ25～35作用于PC12細胞24 h構建AD體外模型。實驗結果表明，模型組細胞活性下降，細胞凋亡率顯著增加，顯示造模成功，故此模型可以作為評價VTP保護作用的AD細胞模型。

從肉蓯蓉、枸杞、黃芪、靈芝等傳統益智中藥中提取的水溶性多糖均具有顯著的改善學習記憶功能；海洋貝類中提取的多糖也具有神經保護活性〔7，8〕。瑣瑣葡萄中有含量較高的多糖，具有較強的抗氧化能力〔9〕。本研究表明VTP對Aβ25～35誘導的神經細胞凋亡具有保護作用。

神經系統病變與細胞凋亡異常密切相關，在慢性神經退行性病變中，包括AD、帕金森病、Huntington舞蹈病等患者，腦組織中大量的神經細胞丟失，其共同的病理機制是神經細胞的凋亡。AD的發生和發展進程中，誘導異常的細胞凋亡，可導致神經元大量丟失，加重神經細胞病理改變，可導致大腦的學習、記憶能力受到影響〔10〕。異常聚集的Aβ對神經元具有毒性作用，在體內體外均可誘導神經細胞凋亡。因此，在研究AD的防治作用機制時，抗神經細胞凋亡已成為重要作用靶點。與細胞凋亡密切相關的Bcl-2家族基因主要分為抑制凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl基因，以及促凋亡基因Bax和Bad基因。如果促凋亡和抗凋亡基因或相關蛋白之間的平衡被打破，可引起異常神經細胞凋亡，可導致神經元的結構與功能損傷〔11，12〕。本研究結果顯示，VTP能減少Aβ25～35誘導的細胞凋亡，提示VTP通過調節凋亡相關基因的表達抑制 Aβ25～35誘導的細胞凋亡。

4參考文獻

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〔2014-12-29修回〕

(編輯曲莉)