附子及附子干姜配伍對心衰大鼠血流動力學和cAMP-PKA信號轉導通路的影響

附子及附子干姜配伍對心衰大鼠血流動力學和cAMP-PKA信號轉導通路的影響

梁濤耿姍周玲玲葛華雯王新宇

(南京中醫藥大學藥理教研室，江蘇南京210023)

摘要〔〕目的研究附子和附子干姜配伍對心衰大鼠血流動力學和環磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA) 信號轉導通路的影響。方法采用鹽酸普羅帕酮注射液靜脈注射法建立心力衰竭動物模型，實驗分為空白組、模型組、附子高、低劑量組(5、2.5 g/kg)、附子∶干姜(1∶1)高、低劑量組(10、5 g/kg)，記錄左心室內壓(LVSP)、左心室內壓最大上升/下降速率(±LVdp/dtmax)；采用酶聯免疫吸附法檢測心臟組織中cAMP、PKA的含量。結果與模型組比較，給藥組均可以升高LVSP和±LVdp/dtmax，其中附子∶干姜(1∶1)高劑量組效果最顯著；與模型組比較，各組給藥后心臟組織中cAMP和PKA含量均增加，其中附子∶干姜(1∶1)高劑量組最顯著。結論附子干姜配伍有明顯的抗心衰作用，可升高心肌組織cAMP、PKA含量，這可能是其作用機制之一。

關鍵詞〔〕附子；干姜；血流動力學；環磷酸腺苷；蛋白激酶A

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金預研基金(12XYY08)；江蘇省科技廳科技支撐計劃(BE2012762)；江蘇省優勢學科建設工程資助項目

第一作者：梁濤(1973-)，女，博士，副教授，主要從事心血管藥理研究。

Effect of aconite and compatibility of aconite dried ginger on hemodynamic parameters and cAMP-PKA signal transduction pathways in rat of chronic heart failure

LIANG Tao, GENG Shan,ZHOU Ling-Ling,etal.

Department of Pharmacology, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210023,Jiangsu, China

Abstract【】ObjectiveTo observe the effects of aconite and compatibility of aconite dried ginger on hemodynamic parameters and cylic adenosine monophsphate(cAMP)-protein kinase A(PKA) signal transduction pathways in rat of chronic heart failure.MethodsThe acute heart failure rat animal model was established by propafenone hydrochloride injection venous injection method.The SD rats were randomly divided into normal, model, aconite(5, 2.5 g/kg), compatibility of aconite dried ginger (1∶1) group (10, 5 g/kg). The hemodynamic parameters left ventricular systolic pressure(LVSP) and maximal derivative of left ventricular pressure(±LVdp/dtmax) were measured.Through ELISA kit, the contents of rat heart tissue cAMP and PKA were detected. ResultsThe levels of LVSP and ±LVdp/dtmax were increased significantly in all groups, the contents of cAMP and PKA were significantly increased. Compatibility of aconite dried ginger had more significant effect in the high dose group. ConclusionsCompatibility of FG has curative effects to acute heart failure, the mechanism may be related to increasing the contents of cAMP and PKA.

【Key words】Aconite; Dried ginger; Hemodynamics; Cylic adenosine monophsphate(cAMP); Protein kinase A(PKA)

附子與干姜同屬辛熱，兩者辛熱同施，是熱熱配伍的典型代表〔1〕。研究表明，附子干姜均具有擴張血管、升高血壓等作用，兩者配伍還具有促進胃腸蠕動等溫通作用〔2～4〕。本實驗觀察附子與干姜附子配伍對心衰大鼠血流動力學的影響，探討附子干姜溫通心陽的作用機制，從現代科學角度闡明中藥配伍的藥性。

1材料與方法

1.1動物SD大鼠60只，雌雄各半，體重200～220 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供〔SCXK(滬)：2007-0005〕。飼養條件：室溫(22±2)℃，濕度40%～60%。

1.2藥物與試劑附子(黑順片)(批號：20130512，南京解放軍第454醫院藥劑科)，干姜(批號：20130512，南京解放軍第454醫院藥劑科)；附子質控標準：含烏頭堿(C34H47NO11)，不得少于1.0%；干姜質控指標：含揮發油不得少于0.8% ml/g，含6-姜辣素不得少于0.6%。鹽酸普魯帕酮注射液(批號：100919，上海愛紫特生物科技有限公司)；環磷酸腺苷(cAMP)試劑盒(批號：20130514)、蛋白激酶A(PKA)試劑盒(批號：20130612)均購自南京建成生物工程研究所。

1.3附子及附子干姜配伍液制備方法附子高劑量組：稱取附子500 g，加10倍量水浸泡30 min，煎煮1 h過濾，連續煎煮3次，合并3次濾液，于水浴鍋上濃縮，濃縮到每1 ml相當于生藥0.5 g。附子低劑量：取附子高劑量藥液稀釋1/2即得。附子干姜配伍(1∶1)高劑量：稱取附子、干姜各500 g，加10倍量水浸泡30 min，煎煮1 h過濾，連續煎煮3次，合并3次濾液，于水浴鍋上濃縮，濃縮至每1 ml相當于生藥1 g。附子干姜配伍低劑量：取附子干姜高劑量藥液稀釋1/2即得。

1.4儀器MP-150生理記錄儀(美國Biopac公司)，MP-2003注射泵(上海雷恩醫療器械有限公司)，JY4001電子天平(上海精密科學儀器有限公司)，HT酶標儀(美國Bio-Tek)，XHF-D勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.5方法

1.5.1大鼠心衰模型建立取健康SD大鼠60只，隨機分組。20%烏拉坦腹腔注射麻醉，仰臥位固定四肢，于頸部腹側偏右縱向切開皮膚，在胸鎖乳突肌內側分離右頸總動脈1.5 cm，立即結扎遠心端，動脈夾夾住近心端，經頸動脈插入充滿肝素的左室導管，松緊度應以切口處不漏血，導管又能自由進出為度。左手用鑷子夾住頸總動脈及導管，右手將導管插入左室腔，感到導管隨心臟搏動而明顯抖動時，則應減慢插進速度。當顯示器上的波形由血壓波變成下沿達0 mmHg附近、具有明顯舒張期且峰頂平坦的波形時表明導管已經通過主動脈瓣進入左室腔，繼續送入導管約0.2～0.3 cm，所有信號均同步記錄于生理記錄儀上〔5〕。待觀察穩定后舌下靜脈快速推注普魯帕酮注射液(10.5 mg/kg)，待動物+dp/dtmax下降至給藥前的20%～40%后以恒流泵股靜脈恒速注射普魯帕酮注射液(2.6 mg/kg)，急性心衰模型穩定5 min以上視為模型成功。

1.5.2大鼠分組與給藥造模成功后，經十二指腸給藥，空白和模型組給予0.9%生理鹽水，附子高、低劑量組(5，2.5 g/kg)和附子∶干姜(1∶1)高、低劑量組(10，5 g/kg)的給藥體積均為10 ml/kg。

1.5.3血流動力學指標檢測觀察給藥后10、20、30、60 min，各組左心室收縮壓(LVSP)和左心室內壓最大上升和下降速率(±LVdp/dtmax)。

1.5.4取材給藥60 min后處死大鼠，取各組心臟稱重，取0.5 g心臟組織加入10 ml預冷生理鹽水，采用內切式組織勻漿機勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清即得心臟組織勻漿液。

1.5.5心臟組織cAMP、PKA的檢測采用酶聯免疫吸附法檢測，具體方法參照試劑盒說明書。

1.6統計學處理采用SPSS11.0軟件進行方差分析。

2結果

2.1對左心室內壓最大上升速率的影響與模型組比較，各給藥組均有升高+dp/dtmax的作用(P<0.05或P<0.01)，附子高劑量組效果強于低劑量組，附子干姜高劑量組效果強于低劑量組，附子干姜高劑量組作用維持時間長，見表1。

2.2對左心室內壓最大下降速率的影響與模型組比較，給藥后各組均有抑制-dp/dtmax下降的作用(P<0.05或P<0.01)。附子干姜高劑量組抑制作用最為明顯、維持時間長，但起效較附子高劑量組慢，見表2。

2.3對左心室內壓的影響與模型組比較，各給藥組LVSP 均上升(P<0.05 或P<0.01)。附子干姜高劑量組LVSP上升最明顯、維持時間長，效果最好，但起效較附子高劑量組慢，見表3。

2.4對心臟組織勻漿中cAMP、PKA含量的影響與模型組比較，各給藥組心臟組織中cAMP和PKA含量均有所增加(P<0.05或P<0.01)，其中附子干姜高劑量組的心臟組織中cAMP和PKA含量增加最顯著，見表4。

表1　各組心衰大鼠左心室內壓最大上升速率變化 ± s， n=10)

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

表2　各組心衰大鼠左心室內壓最大下降速率變化 ± s， n=10)

表3　各組心衰大鼠左心室內壓變化 ± s， n=10)

表4　各組心衰大鼠心臟組織cAMP、PKA含量

3討論

±LVdp/dtmax可一定程度上反映室壁張力的變化速率。+LVdp/dtmax是評價心肌收縮性能的常用指標，-LVdp/dtmax是心肌舒張參數，可作為評價心室舒張功能的指標之一。LVSP為等容收縮期左心室內壓力峰值，當心肌收縮力加強時LVSP上升〔6〕。干姜與附子相伍可改善冠脈血流量，加快心率，改善心衰大鼠的血流動力學。同時，干姜可明顯拮抗附子對心臟的毒性，減少心肌能量需求，達到回陽救逆的目的〔7〕。

cAMP-PKA信號轉導通路對心肌細胞收縮有重要影響。cAMP通過激活PKA使其靶細胞發生蛋白質磷酸化級聯反應，進而調節代謝、基因表達及細胞反應。在心肌細胞內，PKA 可以使Ca2+通道磷酸化，導致Ca2+通道開放，細胞內Ca2+濃度升高，增強心肌收縮力。在心力衰竭的心肌細胞內鈣池里的Ca2+釋放障礙，胞質網膜對Ca2+的通透性降低，Ca2+內流減少，抑制腺苷酸環化酶(AC)，促使第二信使產生抑制效應，cAMP被激活量減少，PKA隨之減少。附子可通過升高大鼠心肌cAMP、PKA含量，提高大鼠心臟收縮能力〔8，9〕。

本實驗結果表明，附子∶干姜(1∶1)高劑量組中cAMP和PKA含量明顯升高，附子配伍干姜改善心衰大鼠血流動力學的機制可能與G蛋白介導的細胞信號轉導途徑cAMP-PKA有關。

4參考文獻

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〔2014-09-17修回〕

(編輯郭菁)