金錢草總黃酮的抗炎活性

金錢草總黃酮的抗炎活性

閻婷李益生

(遼寧醫學院，遼寧錦州121001)

摘要〔〕目的探討金錢草總黃酮提取物的體外抗炎活性。方法通過分析金錢草總黃酮提取物對5-脂氧酶(5-LOX)的抑制作用以及對T細胞的增殖抑制作用，檢測金錢草總黃酮提取物抗炎作用。結果金錢草總黃酮提取物可明顯抑制脂氧酶的活性，并具有一定的T細胞增殖抑制活性。結論金錢草總黃酮提取物具有良好的抗炎活性，其臨床應用的潛力巨大。

關鍵詞〔〕金錢草；總黃酮；抗炎；5-脂氧酶

中圖分類號〔〕R932〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：2012年遼寧醫學院青年科技啟動

第一作者：閻婷(1981-)，女，講師，博士在讀，主要從事天然藥物活性成分研究。

金錢草為報春花科珍珠菜屬植物過路黃的干燥全草，味苦、酸、微寒，歸肝、膽、腎、膀胱經，始載于《本草綱目拾遺》〔1〕。臨床報道具有清熱解毒，利尿排石，活血散淤的作用，用于肝、膽結石，膽囊炎，黃疸性肝炎，泌尿系結石，水腫，跌打損傷；外用治化膿性炎癥，燒燙傷〔2〕。對于該藥的現代藥理學研究多有開展，但是多集中于該藥的臨床排石，抑菌及鎮痛等作用〔3〕；而對于金錢草總黃酮提取物抗炎的作用，均為動物體內實驗活性〔4〕，其分子機制還未見報道。本文探討金錢草總黃酮提取物的抗炎活性。

1材料與方法

1.1試劑與動物5-脂氧酶(5-LOX)(Sigma公司)；辣根過氧化物酶(HRP，上海雪滿生物科技有限公司)；花生四烯酸(AA)、TMPD、Tris(Amresco公司)；實驗采用昆明小鼠為藥理樣本(遼寧醫學院實驗動物中心)。

1.2儀器Flustar微板多功能測定儀(德國BMG公司)；DHZ-D冷凍恒溫震蕩器(江蘇太倉市試驗設備廠)；MH-1型微量振蕩器(江蘇海門其林貝爾儀器制造)；QL-901漩渦振蕩器(江蘇海門麒麟儀器廠)；SZM F124 Ice Maker (SANYO公司)；Milli-Q Plus超純水裝置(美國Millipore公司)；PH計(梅特勒-托利多上海有限公司)；96孔細胞培養板(美國Costar公司)。

1.3金錢草總黃酮提取金錢草藥材加8倍量50%乙醇超聲提取3次，每次45 min，過濾，濾液經石油醚萃取3次，取水相，濃縮，采用NKA-9型大孔吸附樹脂進行純化，以20 mg/ml濃度上樣，6倍量水洗滌，50%乙醇洗脫后得到金錢草總黃酮提取液，冷凍干燥得金錢草總黃酮粉末。

1.4金錢草總黃酮對5-LOX的抑制作用AA先被5-LOX催化生成5-羥基過氧四烯酸，經辣根過氧化酶(HPR)以5-羥基過氧四烯酸和TMPD為底物作用生成600 nm處有吸收的物質。96孔板分別加入空白組、對照組和實驗組，每組均設置6個復孔。空白組中每孔加入Tris-HCl(0.1 mol/L，pH7.0)190 μl和10 μl的HPR；對照組每孔加170 μl的 Tris-HCl(0.1 mol/L，pH7.0)、10 μl的5-LOX(700 U/孔)和20 μl的HPR(700 μg/ml)；實驗組每孔中加入160 μl的Tris-HCl(0.1 mol/L，pH7.0)、10 μl的總黃酮提取物、10 μl的5-LOX(700 U/孔)和20 μl的HPR 700 μg/ml。輕輕振搖96孔板混勻溶液，37℃孵育10 min。加樣孔中加入10 μl的TMPD(2.8 mg/ml)。加樣孔中再加入10 μl的AA。輕輕振搖96孔板混勻溶液，25℃孵育。酶標儀設置600 nm處讀取OD值。金錢草總黃酮濃度設置高、中、低三個劑量，分別為1、0.1、0.01 mg/ml。

1.5金錢草總黃酮對小鼠T細胞的增殖抑制作用托頸處死小鼠，75%酒精浸泡1 min，超凈臺上解剖取出脾臟，去除結締組織后PBS漂洗。置于裝有完全DMEM培養基(10%胎牛血清和1%雙抗)的一次性平皿中，無菌注射器將脾臟一端扎幾個小孔后，注射器吸取完全DMEM培養基從脾臟另一端扎入并將脾臟內細胞吹出，反復幾次。淋巴細胞懸液1 000 r/min離心5 min，棄去上清后加紅細胞裂解液重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，反復幾次直至紅細胞全部裂解。臺盼藍染色計數活細胞。配制2×109個/L的淋巴細胞懸液，96孔板中每孔加入100 μl淋巴細胞懸液和10 μl的待測藥物，5%CO2、37℃孵育60 min，再加入10 μl的Con A(終濃度為10 μg/ml)，同上條件孵育48 h。每孔均加入MTT(濃度5 mg/ml)10 μl，同上條件孵育4 h后，去掉上清，加入DMSO 100 μl，微量震蕩后酶標儀檢測570 nm的OD值。藥物濃度分別1 000、100、10、1、0.1 μg/ml。抑制率%=1-OD加藥/OD對照。

1.6統計學分析采用SPSS17.0進行單因素方差分析。

2結果

2.1金錢草總黃酮對5-LOX的抑制作用0.01、0.1、1 mol/ml的金錢草總黃酮對5-LOX的抑制率分別為2.5%、53.7%及70.5%。

2.2金錢草總黃酮對小鼠T細胞的增殖抑制作用見表1。在總黃酮濃度為0.1 mg/ml時，金錢草總黃酮呈現了微弱的抑

表1　金錢草總黃酮對T細胞增殖的抑制作用 ± s)

與對照組比較：1)P<0.05

制趨勢，而隨著濃度的上升，其抑制能力也顯著上升，當總濃度達到10 mg/ml時，體系的抑制效率同對照組相比呈現了明顯的差異，表明金錢草總黃酮有明顯抗炎活性。

3討論

臨床上對于該藥的利用多為排石，如方劑中的復方金錢草顆粒，膽寧片等〔5，6〕。一般認為金錢草的功效為清熱利濕及通淋，其相應的藥理作用則可能在于對膽囊的促進及對人體成石率的抑制，并提高患者的腎臟系數。同時，針對尿道感染，金錢草也可起到相應的作用，楊寧寧等〔7〕研究表明，金錢草對于下尿路的感染效果明顯優于傳統的阿莫西林。但是對于金錢草抗炎的研究，仍然僅針對動物的體外實驗，而對機制層面的研究不多。對于其抗炎作用的解釋僅僅從傳統醫學理論中的利濕角度出發〔8〕，但是尚未解釋金錢草總黃酮在此過程中的作用。同時，大量的藥理研究表明，黃酮類物質擁有良好的抗炎藥理學活性〔9〕。而作為金錢草的主要成分，總黃酮與金錢草的種種活性密切相關，但是對于金錢草總黃酮的研究仍然是清除結石〔10〕，而對于其與抗炎活性的相關性研究尚顯不足。可以推測，金錢草或其相關成藥中的總黃酮，在其抗炎機制中會起到一定的作用。

作為一種長單鏈蛋白質，5-LOX廣泛的存在于動植物的組織中。在人等哺乳動物體內，5-LOX可將AA氧化成5-羥基四烯酸和5-羥基過氧四烯酸(5-HPETE)最終生成白三烯類化合物。同時，導致血管通透性增加、血漿外滲，引起平滑肌尤其是支氣管平滑肌收縮，引起支氣管哮喘。而本模型的原理則是AA先被5-LOX催化氧化生成5-羥基過氧四烯酸，然后HPR以5-羥基過氧四烯酸和TMPD為底物生成一種物質，并在610 nm處產生吸收。再通過反應液在紫外分光光度計下吸收值的不同，確定相應提取物對于脂氧酶的抑制作用。本研究則主要測試了金錢草總黃酮的抗炎作用，這與臨床報道〔7〕是相符的。但是，該報道僅從金錢草總黃酮的抗菌作用角度出發，而筆者的研究則從分子角度對該結果進行闡述，并由此推論，金錢草的抗感染療效是抑菌同抗炎相結合的雙重作用的結果。特別是金錢草中的黃酮，在抗炎的過程中發揮了巨大的作用。

金錢草可以有效地抑制脂氧酶活性，并產生了顯著的抗炎作用，為進一步驗證該結果，進行了抑制小鼠體外T淋巴細胞抗炎的實驗。淋巴細胞是人體內的主要免疫細胞，而其中的T細胞擁有細胞免疫功能，然而其過度的增殖，則會介導某些自身免疫性疾病，如風濕性關節炎、斑禿及系統性紅斑狼瘡等。同時，在風濕性關節炎的病理環節中，T細胞也起到了重要的作用〔11〕。同時，在正常及病理性應答條件下，T細胞的活化在免疫應答中有著關鍵的作用〔12〕。基于此，本結果表明，金錢草總黃酮對小鼠的T細胞有著特異性的抑制作用，特異性的抑制T細胞的活化程度，可以對風濕性關節炎等免疫系統疾病起到明顯的治療作用，且對各種過敏性疾病也可以起到防治作用。

本文通過對金錢草總黃酮提取物的細胞藥理分析發現，金錢草總黃酮可以有效地抑制5-LOX的活性，并抑制小鼠體外T細胞的增殖，體系體現出顯著的抗炎作用。然而，由于中藥的復雜性，特別是復方的綜合作用，金錢草的抗炎作用不僅僅是總黃酮的單一作用，其他的單體成分也會對其抗炎產生協同作用。本文從黃酮類化合物的抗炎特性出發，確定了金錢草總黃酮抗炎活性的物質基礎及代謝機制，為臨床用藥及進一步的研究提供了新的思路，而對其全面的抗炎活性，需綜合臨床效果及其他藥理模型進一步確認。

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〔2014-06-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)