硫化氫對糖尿病大鼠心臟MMP-2與MMP-12的影響

硫化氫對糖尿病大鼠心臟MMP-2與MMP-12的影響

羅健吳志雄周松柏肖婷李芳楊軍

(南華大學附屬第一醫院心血管內科，湖南衡陽421001)

摘要〔〕目的探討氣體信號分子硫化氫(H2S)對鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠基質金屬蛋白酶(MMP)-2及MMP-12的影響。方法SD大鼠隨機分為對照組、糖尿病大鼠組(STZ組)、H2S干預糖尿病大鼠組(STZ+H2S組)及H2S干預正常大鼠組(H2S組)。腹腔注射STZ 40 mg/kg建立糖尿病模型；糖尿病模型建立后，STZ組與H2S組每天腹腔注射濃度為100 μmol/kg的硫氫化鈉溶液(H2S供體)；8 w后處死大鼠，Western印跡檢測各組大鼠心臟MMP-2和MMP-12蛋白的表達。結果糖尿病大鼠心臟MMP-2與MMP-12表達水平明顯減低(P<0.01,P<0.05)，H2S可以明顯上調糖尿病大鼠心臟MMP-2與MMP-12的表達(P<0.01)；結論H2S可通過上調MMP-2及 MMP-12的表達，改善心肌纖維化。

關鍵詞〔〕硫化氫；糖尿病；心肌纖維化；MMP-2；MMP-12

中圖分類號〔〕R542.2〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金(No.81202830)；湖南省自然科學基金(11JJ2046)

通訊作者：楊軍(1972-)，男，主任醫師，博士，碩士生導師，主要從事心血管疾病研究。

第一作者：羅健(1988-)，男，碩士，主要從事心血管疾病研究。

心臟是糖尿病患者中最易受損傷的器官之一，表現為心肌重構，最終導致心臟收縮和(或)舒張功能障礙〔1〕，心肌纖維化與心臟收縮、舒張功能聯系尤為密切。硫化氫(H2S)是一種新型氣體信號分子，在心血管系統中，H2S作為一種心臟保護劑，有抗動脈粥樣硬化、調節血壓等生理作用〔2〕。H2S能夠改善糖尿病心臟重構，對肺纖維化和肝纖維化都有改善作用〔3,4〕，提示H2S是一種有效的抗纖維化劑。本研究觀察基質金屬蛋白酶(MMP)-2及MMP-12在糖尿病大鼠心臟表達的變化及H2S對MMP-2和MMP-12表達的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物成年的雄性SD大鼠，體重(300±20)g，購自長沙動物實驗中心。動物飼養在恒溫(23±1)℃、恒濕(60%)的環境中，白天黑夜各12 h；實驗動物可以自由獲得食物和水。

1.2主要實驗試劑硫氫化鈉(H2S供體)購于美國Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒、細胞裂解液購于上海碧云天公司；兔源性MMP-2及MMP-12一抗購于中國博士德公司；抗兔二抗購于美國Proteintech公司。

1.3實驗分組及糖尿病模型建立飼養SD大鼠1 w，使其適應環境。將SD大鼠隨機分為對照組、糖尿病大鼠組(STZ組)、H2S干預糖尿病大鼠組(STZ+H2S組)及H2S干預正常大鼠組(H2S組)。STZ組與STZ+H2S組大鼠根據體重腹腔注射STZ(40 mg/kg)，注射后的24 h，為防止大鼠發生低血糖休克，給予5%葡萄糖水；注射后72 h，尾靜脈采血測血糖，血糖>16.7 mmol/L提示造模成功。造模成功后，對照組每天腹腔注射生理鹽水；STZ組與H2S組每天腹腔注射硫氫化鈉溶液(100 μmol/kg)，實驗持續8 w。

1.4Western印跡檢測MMP-2及MMP-12的表達取新鮮大鼠心臟組織，研磨、離心后提取蛋白；采用BCA比色法進行蛋白定量。各組用PBS稀釋至相同濃度，蛋白樣品在100℃煮沸5 min；配制10%SDS-PAGE 分離膠、5%濃縮膠；按每孔20 μl蛋白樣品上樣，置于電泳緩沖液中電泳，分離目的蛋白，將目的條帶切下，半干轉法轉膜(10 V， 30 min)，將蛋白質轉移至PVDF膜。用TBST配制的5%BSA封閉2 h，封閉后分別孵育MMP-2及MMP-12一抗(稀釋度均為1∶500)，4℃過夜；用TBST洗膜；每次10 min；用HRP標記的二抗(稀釋度為1∶2 000)37℃孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯色，曝光后掃描，用Image J圖像分析軟件進行光密度分析。

1.5統計學分析采用SPSS18.0軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1H2S對糖尿病大鼠心臟MMP-2表達的影響糖尿病大鼠心臟MMP-2表達明顯下降(P<0.01)，而使用H2S處理的糖尿病大鼠心臟MMP-2表達顯著上升(P<0.01)；H2S處理的正常大鼠的心臟MMP-2表達無明顯變化，見圖1。

2.2H2S對糖尿病大鼠心臟MMP-12表達的影響糖尿病大鼠心臟MMP-12表達明顯下降(P<0.05)，H2S也能上調糖尿病大鼠心臟MMP-12表達(P<0.01)，見圖2。

圖1　H 2S對MMP-2表達的影響

圖2　H 2S對MMP-12表達的影響

3討論

心血管病并發癥是糖尿病最主要的死亡原因，終末期的臨床表現就是心臟收縮和(或)舒張功能障礙，也就是心力衰竭。從病理學的角度分析主要是由于糖尿病患者心臟發生重構，包括了心肌細胞肥大和心肌纖維化〔5〕；其中心肌纖維化表現為心肌細胞外基質增多，心肌膠原纖維增加，膠原排列紊亂，這一系列的病理改變會導致心臟順應性下降，對心臟收縮和舒張功能產生負面影響〔6〕。MMP-2與MMP-12可能作為一種抗纖維化的蛋白，維持心臟細胞外基質的動態平衡，而高血糖導致MMP-2及MMP-12表達下調，導致心肌纖維化，H2S可能通過上調這兩種MMP改善糖尿病大鼠心肌纖維化。

MMPs是調節細胞外基質平衡的一種重要的酶系統，MMP-2屬于明膠酶類，有研究〔7,8〕表明其在糖尿病心臟中表達明顯降低，這與本研究結果相同。MMP-12對心肌纖維化的影響尚無報道，但其可以激活其他MMPs，如MMP-3、MMP-3，使膠原蛋白降解的作用加快、放大〔9〕。H2S是一種具有廣泛生理功能的氣體信號分子。H2S的抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，在心血管系統和神經系統中扮演著保護劑的角色。H2S能夠改善糖尿病心臟重構，對肺纖維化和肝纖維化都有改善作用，提示H2S是一種有效的抗纖維化劑。本研究發現H2S明顯逆轉了糖尿病所致大鼠心臟MMP-2及MMP-12表達下降，提示H2S可能通過上調MMP-2及MMP-12表達改善糖尿病心肌纖維化。本實驗是對H2S對糖尿病纖維化改善作用的初步探討，其保護作用的信號轉導、途徑等具體機制有待深入研究，為糖尿病心肌病的預防及治療提供一個新的研究思路。

4參考文獻

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4李虹,劉新民,耿彬,等.新型氣體信號分子硫化氫在大鼠肺纖維化發病中的作用〔J〕.北京大學學報(醫學版),2006;40(2):140-5.

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7Mohamad HE,Askar ME,Hafez MM.Management of cardiac fibrosis in diabetic rats;the role of peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPAR-gamma) and calcium channel blockers (CCBs)〔J〕.Diabetol Metab Syndr,2011;3(1):4.

8王國賢,王蕾蕾.葛根素對糖尿病大鼠心肌纖維化的影響〔J〕.江蘇大學學報(醫學版),2011;21(4):294-7,72.

9Edelstein C,Shapiro SD,Klezovitch O,etal.Macrophage metalloelastase,MMP-12,cleaves human apolipoprotein(a) in the linker region between kringles IV-4 and IV-5.Potential relevance to lipoprotein(a) biology〔J〕.J Biol Chem,1999;274(15):10019-23.

〔2014-10-17修回〕

(編輯李相軍)