TLR4在慢性支氣管炎大鼠模型中對炎癥損傷與黏液分泌的調控作用

TLR4在慢性支氣管炎大鼠模型中對炎癥損傷與黏液分泌的調控作用

萬寧張建勇1

(宜賓市第一人民醫院呼吸內科，四川宜賓644000)

摘要〔〕目的觀察TLR4在細菌內毒素(LPS)致慢性支氣管炎大鼠模型中對氣道炎癥損傷與黏液分泌的調控作用。方法SPF級雄性Wistar大鼠40只，隨機分為正常對照組(NS組)、慢性支氣管炎組(LPS組)、多粘菌素B干預組(LPS+PMB組)、多粘菌素B自身對照組(PMB組)，每組10只。用氣管內注入LPS 200 μg/200 μl及每日LPS溶液霧化吸入1 h的方法建立慢性支氣管炎動物模型，3 w后收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)進行細胞學計數和白細胞分類檢測，酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法測定BALF中腫瘤壞死因子(TNF)-α含量，對大鼠肺臟進行病理學檢查，肺組織阿先藍過碘酸雪夫(AB-PAS)陽染面積，用免疫組化法觀察黏蛋白Muc5AC、TLR4在支氣管肺內的表達及熒光定量RT-PCR Muc5AC mRNA、TLR4 mRNA在肺內的表達。結果LPS組大鼠BALF細胞總計數、中性粒細胞個數、TNF-α水平。AB-PAS陽染面積、Muc5AC、TLR4蛋白表達量及Muc5AC mRNA、TLR4 mRNA水平與LPS+PMB組比較有顯著性差異(均P<0.05)，NS組和PMB無統計學差異(P>0.05)。結論TLR4介導LPS誘發的慢性呼吸道炎癥反應可能導致Muc5AC 蛋白與mRNA高表達。多粘菌素B可能通過抑制肺組織TLR4 mRNA及其蛋白的表達而抑制氣道黏液高分泌。

關鍵詞〔〕慢性支氣管炎；內毒素；多粘菌素B；TLR4；Muc5AC

中圖分類號〔〕R562.2〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：貴州省科技計劃課題(黔科合SY字〔2008〕3056)

通訊作者：張建勇(1966-)，男，醫學博士，主任醫師，主要從事氣道炎癥及黏液高分泌研究。

1遵義醫學院附屬醫院呼吸二科

第一作者：萬寧(1979-)，女， 碩士，主治醫師，主要從事慢性阻塞性肺疾病氣道黏液高分泌性研究。

氣道黏液高分泌是慢性氣道疾病的重要特征，確切發生機制及調控目前尚不十分清楚。氣道黏液高分泌的分子基礎是氣道主要黏蛋白(Muc)5AC的產生和分泌增加〔1〕，而細菌感染是慢性氣道疾病發生發展或反復加重的重要因素，其中G-菌是最主要的致病菌之一，而脂多糖(LPS)則是G-菌感染的主要致病因子。本實驗將探討TLR4信號轉導通路在細菌LPS誘導大鼠慢性支氣管炎氣道黏蛋白表達中的作用，為氣道黏液高分泌的藥物干預治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1慢性支氣管炎模型建立與分組SPF級6～8周齡雄性Wistar大鼠40只(購自重慶第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心)，體重約220～240 g，隨機分為正常對照組(NS組)、慢性支氣管炎組(LPS組)、多粘菌素B干預組(LPS+PMB組)、多粘菌素B自身對照組(PMB組)，每組10只。參考Nie等〔2〕的方法，并作改進，建立大鼠慢性支氣管炎模型：第1天氣管內注入脂多糖(LPS)200 μg/200 μl(E.coli 055:B5，美國Sigma公司)后，每天在自制玻璃箱(50 cm×50 cm×40 cm)內霧化吸入(德國百瑞壓縮吸入器，型號：085G1005)LPS溶液(50 μg/ml)1 h，連續3 w。NS組用NS代替LPS。LPS+PMB組：建立大鼠慢性支氣管炎模型(方法同前)外，于每日霧化吸入前1 h給予腹腔注射PMB 1 mg/kg干預(美國Amresco)。PMB組：同正常對照組外，于每日霧化吸入前1 h給予腹腔注射PMB 1 mg/kg。

1.2肺組織標本和支氣管肺泡灌洗液制備大鼠持續霧化吸入3 w后處死，取右上、中葉肺組織迅速放入-80℃冰箱保存，以備RNA提取。取右下葉肺組織放入4%多聚甲醛中固定。左肺行支氣管肺泡灌洗獲得BALF做細胞計數、白細胞分類和細胞因子腫瘤壞死因子(TNF)-α測定〔3〕。

1.3ELISA測定BALF細胞因子TNF-α采用ELISA雙抗體夾心法，按試劑盒說明書進行檢測(上海森雄科技實業有限公司)，酶標儀(ELX800，美國)在492 nm處測吸光度。

1.4AB-PAS染色肺組織石蠟切片，常規脫蠟至水，做AB-PAS染色，進行圖片采集和相對著色面積定量分析。

1.5免疫組化法檢測氣道Muc5AC和肺組織TLR4的表達均采用二步法，Muc5AC一抗為小鼠抗Muc5AC單克隆抗體(SANTA公司)，鼠抗-Muc5AC抗體二步法試劑盒(北京中杉金橋生物公司)。TLR4一抗為羊抗大鼠TLR4多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，羊抗-TLR4抗體二步法試劑盒(北京中杉金橋生物公司)。均按試劑盒說明進行操作，以積分光密度(IOD)為指標進行定量分析。

1.6熒光定量RT-PCR檢測肺組織Muc5AC和TLR4 mRNA表達。采用RNAiso Reagent試劑(TaKaRa公司)參照說明書提取各組大鼠肺組織總RNA，取0.5 μg RNA逆轉錄(逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司，DRR037S)，按試劑盒說明書合成cDNA。Muc5AC、TLR4及內參照β-actin的引物由TaKaRa公司設計合成，其序列見表1。按PCR反應試劑盒(TaKaRa公司，DRR041S)說明書進行PCR反應(ICycler iQ熒光定量PCR儀，美國BIO-RAD公司)，反應條件均為：95℃ 10 s；95℃ 5 s，62℃ 20 s，共40個循環。每一例樣本反應結束后由計算機自動計算并讀出定量結果Ct值。各組數據采用2-△△Ct法進行相對定量。

表1　Muc5AC、TLR4、β-actin引物序列

1.7統計學處理采用SPSS13.0軟件行方差分析。

2結果

2.1HE染色結果NS組和PMB組大鼠支氣管管壁及其周圍組織結構完整而清晰，未見或偶見很少量炎性細胞。LPS組見支氣管上皮細胞損傷脫落，杯狀細胞明顯增多，支氣管壁及其周圍組織和肺泡以中性粒細胞和巨噬細胞為主的大量炎性細胞浸潤，炎癥細胞浸潤明顯處可見管壁平滑肌束斷裂，排列紊亂，管腔狹窄。與LPS組比較，LPS+PMB組大鼠上述病變明顯減輕。

2.2BALF細胞計數和白細胞分類NS組和PMB組大鼠BALF白細胞總數和細胞分類無差異(P>0.05)，主要以巨噬細胞為主。LPS組BALF白細胞總數、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞均較NS組明顯增多(均P<0.01)。LPS+PMB組細胞總數、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞與LPS組比較明顯減少(均P<0.01)，而較NS組有所增加。見表2。

表2　各組大鼠BALF細胞計數變化

2.3BALF細胞因子TNF-α水平測定NS組〔(70.35±5.84)pg/ml〕和PMB組〔(71.01±3.47)pg/ml〕BALF中TNF-α水平無差異(P>0.05)，LPS組〔(172.91±4.16)pg/ml〕、LPS+PMB組〔(96.95±7.50)pg/ml〕BALF中TNF-α水平較NS組明顯增高(P<0.01)，LPS+PMB組增高值較LPS組低(P<0.01)。

2.4氣道AB-PAS染色AB-PAS染色結果顯示：NS組和PMB組氣道黏液物質染色無明顯差別〔(1.54±0.12)%,(1.52±0.03)%〕(P>0.05)。LPS組、LPS+PMB組氣道黏液物質相對著色面積〔(28.20±1.22)%,(13.30±1.49)%〕較NS組明顯增高(P<0.01)。LPS+PMB組增高值較LPS組低(P<0.01)。

2.5免疫組化法檢測氣道Muc5AC和肺組織TLR4的表達Muc5AC表達于支氣管管腔內，其余肺組織未見表達。NS組和PMB組Muc5AC表達低，且二者無差異(P>0.05)。LPS組可見大量Muc5AC表達，其IOD值明顯高于NS組(P<0.01)。LPS+PMB組表達量較LPS組明顯減低(P<0.01)，但仍高于NS組(P<0.01)。TLR4主要表達于支氣管上皮、肺泡、血管壁等，均為膜表達。TLR4均在NS組和PMB組表達低，且無差異(P>0.05)。LPS組可見大量TLR4表達，其IOD值明顯高于NS組(P<0.01)。LPS+PMB組表達量較LPS組明顯減低(P<0.01)，但仍高于NS組(P<0.05)。見表3。

表3　各組大鼠氣道Muc5AC和肺組織

與NS組比較：1)P<0.01，與LPS組比較：2)P<0.01；下表同

2.6熒光定量RT-PCR檢測肺組織Muc5AC和TLR4 mRNA表達NS組和PMB組大鼠氣道黏蛋白Muc5AC mRNA表達量低，且二者無差異(P>0.05)。LPS組較NS組表達明顯增高(P<0.05)，LPS+PMB組表達量增高，但低于LPS組(P<0.05)。TLR4 mRNA在NS組和PMB組大鼠肺組織表達量低，且二者無差異(P>0.05)；LPS組較NS組明顯增高(P<0.05)；LPS+PMB組表達量增高，但低于LPS組(P<0.05)。見表4。

表4　大鼠肺組織Muc5AC和TLR4 mRNA表達 ± s, n=10)

3討論

氣道黏液高分泌是影響慢性氣道疾病如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支氣管哮喘及囊性纖維化等病情和預后的獨立危險因素〔3，4〕。黏蛋白是氣道黏液的最主要成分。研究證實，氣道Muc在病理狀態下主要表現為Muc5AC，氣道Muc5AC含量及其轉錄水平代表慢性支氣管炎患者氣道黏液分泌強度〔5〕。

由于氣道炎癥反應及黏液分泌發生、發展與細菌感染有著直接的關系。G-菌是構成呼吸道感染的最關鍵致病菌，而LPS是決定G-菌致病力的關鍵霉素。TLR是LPS主要受體，其作用主要體現在免疫應答和炎性反應。人類氣道上皮細胞存在TLR，其中TLR4主要分布于細胞基底膜。在LPS刺激下，可使TLR激活并通過TLRs信號通路介導多種生物學效應。

在LPS刺激下，氣道上皮細胞的TLR水平升高，且主要是TLR4上調。LPS可誘使豚鼠氣道上皮黏蛋白分泌增多和杯狀細胞化生，銅綠假單胞菌脂多糖刺激NCI-H292細胞MUC5AC、TLR4基因表達和蛋白質的生產。向大鼠氣管內滴入綠膿假單胞菌LPS，可引起大量中性粒細胞聚集以及廣泛的氣道上皮細胞型改變，蛋白分泌明顯升高。本研究使用LPS成功搭建大鼠慢性支氣管炎和氣道黏液高分泌模型，進一步佐證了炎癥細胞浸潤程度決定氣道黏液分泌量的內在關系。

作為TLR4最主要的配體，明確LPS與TLR4在慢性支氣管炎發病中扮演的角色十分必要。本研究結果顯示，LPS水平與TLR4 mRNA表達正相關；另外，低濃度LPS刺激后TLR4 mRNA表達上調，且肺組織炎癥改變加重，氣道阻力加大，氣道壁厚度增加；但高濃度LPS刺激后雖然TLR4 mRNA表達上揚趨勢更明顯，但肺組織炎癥卻減輕，氣道阻力和氣道壁厚度均改善。由此說明，TLR4在參與支氣管炎癥發生和氣道重組過程中發揮著重要角色。

通過本研究可以推測， TLR4信號通路介導的細菌LPS作用與氣道黏蛋白Muc5AC的產生及其高表達之間可能存在必然聯系。PMB通過對抗LPS，可能抑制氣道Muc5AC、TLR4蛋白及Muc5AC mRNA、TLR4 mRNA表達。

4參考文獻

1Ryan A,Smith A,Moore P,etal.Expression and Characterization of a novel recombinant version of the secreted human mucin MUC5AC nairway cell lines〔J〕.Biochemistry,2015;54(4):1089-99.

2Nie YC,Wu H,Li PB,etal.Characteristic comparison of three rat models induced by cigarette smoke or combined with LPS:to establish a suitable model for study of airway mucus hypersecretion in chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Pulm Pharmacol Ther,2012;25(5):349-56.

3Mizuguchi Y1,Myojo T,Oyabu T,etal.Comparison of dose-response relations between 4-week inhalation and intratracheal instillation of NiO nanoparticles using polimorphonuclear neutrophils in bronchoalveolar lavage fluid as a biomarker of pulmonary inflammation〔J〕.Inhal Toxicol,2013;5(1):29-36.

4Rubin BK.Secretion properties,clearance,and therapy in airway disease〔J〕.Transl Respir Med,2014;10(3):2-6.

5Xu R,Li Q,Zhou X,etal.Annexin Ⅱ mediates the neutrophil elastase-stimulated exocytosis of mucin 5ac〔J〕.Mol Med Rep,2014;9(1):299-304.

〔2015-08-30修回〕

(編輯曲莉)