沉默LAIR-1表達對乳腺癌細胞增殖和侵襲功能的影響

沉默LAIR-1表達對乳腺癌細胞增殖和侵襲功能的影響

趙徽安雪青呂健東

(天津市第五中心醫院普外科，天津300450)

摘要〔〕目的探討白細胞相關免疫球蛋白樣受體(LAIR)-1在乳腺癌組織中的表達及其對乳腺癌細胞增殖和侵襲能力的影響。方法采用RT-PCR方法檢測乳腺癌細胞系和組織標本中LAIR-1 mRNA的表達情況。采用電穿孔轉染法，將LAIR-1 siRNA轉染MCF-7細胞，通過Western印跡檢測LAIR-1在MCF-7細胞中的表達情況。通過四甲基偶氮唑藍比色(MTT)增殖實驗檢測LAIR-1對MCF-7細胞增殖的影響。通過傷Boyden小室檢測LAIR-1對MCF-7細胞侵襲能力的影響。結果同癌旁組織相比，乳腺癌組織中LAIR-1 mRNA的表達量顯著降低(P<0.01)；且同非轉移性乳腺癌組織相比，轉移性乳腺癌組織中LAIR-1 mRNA的表達量亦顯著降低(P<0.01)。轉染LAIR-1 siRNA可顯著抑制MCF-7細胞中LAIR-1的表達。抑制LAIR-1表達后，MCF-7細胞的增殖和侵襲能力均顯著升高(P<0.01)。結論LAIR-1具有抑制乳腺癌細胞增殖和侵襲的作用，乳腺癌組織中LAIR-1的低表達可能與乳腺癌的發生發展相關。

關鍵詞〔〕白細胞相關免疫球蛋白樣受體-1；乳腺癌；增殖；侵襲

中圖分類號〔〕R739〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：呂健東(1967-)，男，碩士，主任醫師，主要從事甲狀腺、乳腺、胃腸道腫瘤研究。

第一作者：趙徽(1985-)， 女，碩士，主要從事專業乳腺外科研究。

乳腺癌轉移是導致乳腺癌患者死亡的主要原因，然而乳腺癌轉移的機制目前尚未完全研究清楚。白細胞相關免疫球蛋白樣受體(LAIR)-1是一種具有免疫抑制功能的受體〔1〕。研究表明，LAIR-1分子在卵巢癌組織細胞和細胞系中存在不同水平的表達，且沉默卵巢癌細胞系(HO8910)細胞中LAIR-1分子表達可明顯增強HO8910細胞的增殖能力〔2〕。關于LAIR-1分子在乳腺癌組織中的表達情況及其與乳腺癌發生發展的關系目前還未見相關文獻報道。本文旨在探討LAIR-1分子在乳腺癌發生發展中的作用，以期為乳腺癌診斷尋找一個新的有效的腫瘤分子標志物。

1材料與方法

1.1臨床資料選取2013 年10月11日至2014 年12月30日我院乳腺外科收治的乳腺癌患者60例，平均年齡(61.3±14.8)歲，其中轉移性乳腺癌患者和非轉移性乳腺癌患者各30例。術前均未接受任何放化療和免疫治療。收取乳腺癌患者的癌組織標本和癌旁組織標本，離體后均立即凍存于液氮中，均經過組織病理學診斷證實為乳腺癌。

1.2細胞及主要試劑人乳腺癌細胞系(MD231)及MCF7細胞均購自中國醫學科學院基礎醫學研究所，細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中。胎牛血清及DMEM培養基購自Hyclone公司，Lonza轉染試劑購自Lonza公司； TRIzol購自美國Invitrogen公司；SYBR Green PCR試劑盒購自Ambion公司；侵襲實驗用Boyden小室購自美國Millipore公司。

1.3RT-PCR 取出液氮中保存的組織，研碎，采用Trizol提取組織RNA，反轉錄成cDNA。聚合酶鏈反應(PCR)條件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 20 s，共40個循環。以2-△△Ct方法計數LAIR-1的相對表達量。LAIR-1上游引物：5'-CCGTCGGACAACAGTCACAA-3'；下游引物：5'-CGTCGGACAACAGTCACAATTT-3'。細胞長至70%融合時可用于轉染。嚴格按照Lonza轉染說明書進行操作，轉染36 h后可用于功能實驗〔3〕。采用Western印跡方法檢測MCF-7細胞中LAIR-1的表達情況〔4〕，四甲偶氮唑藍比色(MTT)方法檢測LAIR-1對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響〔5〕。采用Boyden小室分析檢測細胞侵襲能力〔5〕。

1.4統計學方法應用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2結果

2.1LAIR-1在乳腺癌組織及乳腺癌細胞系中的表達乳腺癌癌旁組織中，LAIR-1的相對表達量為1.38±0.15，乳腺癌組織中為0.54±0.05，二者相比差異顯著(P<0.01)。非轉移性乳腺癌組織中的LAIR-1的相對表達量為0.64±0.11，轉移性乳腺癌組織中為0.33±0.02，二者相比差異顯著(P<0.01)。低侵襲能力的乳腺癌細胞系MCF-7中LAIR-1的相對表達量為0.93±0.22，高侵襲能力的乳腺癌細胞系MD231中為0.69±0.16，二者相比差異顯著(P<0.01)。

2.2轉染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7細胞中LAIR-1表達檢測轉染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7細胞中LAIR-1的表達被顯著抑制。見圖1。

圖1　轉染LAIR-1 siRNA的乳腺癌 MCF-7細胞中LAIR-1表達檢測

2.3siRNA干擾抑制LAIR-1增加乳腺癌MCF-7細胞的增殖能力乳腺癌MCF-7細胞轉染第3天時，增殖能力在模擬組、對照組和轉染LAIR-1 siRNA組分別為(0.67±0.11)、(0.69±0.09)和(1.14±0.14)；第5天時，分別為(1.17±0.21)、(1.19±0.18)和(2.07±0.41)；第7天時，分別為(1.86±0.23)、(1.91±0.25)和(2.56±0.26)。轉染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7細胞增殖能力顯著升高(P<0.01)。

2.4siRNA干擾抑制LAIR-1增加乳腺癌MCF-7細胞的侵襲能力轉染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7細胞發生侵襲的細胞數分別為(46.24±13.54)、(45.36±15.63)和(106.13±25.46)。轉染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7細胞侵襲能力顯著升高(P<0.01)。見圖2。

圖2　LAIR-1對乳腺癌MCF-7細胞侵襲能力的影響

3討論

腫瘤是世界人口死亡的第2大原因，近30年來世界范圍內腫瘤致死率增加近2倍〔6〕。腫瘤種類約有200多種，其中乳腺癌、肺癌、結直腸癌和前列腺癌總發病率約占所有癌癥發生率的一半以上〔7〕。乳腺癌是腫瘤最常見的一種類型，占腫瘤發病率的27%，致死率占腫瘤致死率的16%。已知乳腺癌轉移是導致乳腺癌患者死亡的主要原因。然而，乳腺癌轉移的機制目前尚未完全研究清楚。

LAIR-1是一種具有免疫抑制功能的受體，含有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)〔2～4〕。LAIR-1主要表達于髓系細胞和淋巴細胞中，包括自然殺傷(NK)細胞、T細胞、B細胞、單核細胞、單核細胞來源樹突細胞(DC)和造血祖細胞〔8～10〕。結合以往研究結果證實高表達于免疫細胞的多種抑制性受體家族成員，

如程序死亡受體-1(PD-1)和NK細胞抑制性受體(NKG2A)均與腫瘤免疫逃逸相關。國內已有研究發現，腫瘤細胞也表達LAIR-1〔11〕，推測LAIR-1與腫瘤的發生發展相關。研究表明，LAIR-1分子在卵巢癌組織細胞和細胞系中存在不同水平的表達，且沉默卵巢癌細胞系(HO8910)細胞中LAIR-1分子表達可明顯增強HO8910細胞的增殖能力。雖然已證實LAIR-1在卵巢癌中發揮重要作用，但關于LAIR-1表達于乳腺癌腫瘤細胞的報道還沒有，且其作用機制尚未完全明確。

本研究結果初步提示LAIR-1分子與乳腺癌的發生發展密切相關。另外，當敲低乳腺癌MCF-7細胞中LAIR-1分子的表達后，乳腺癌MCF-7細胞的增殖和侵襲能力均顯著升高。

綜上，LAIR-1分子可通過影響乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力進而發揮乳腺癌抑制作用。乳腺癌中LAIR-1分子表達的顯著降低與乳腺癌的發生和發展密切相關。

4參考文獻

1王雷，馬菲，郭寶良.MicroRNA在三陰型乳腺癌中的研究進展〔J〕.中國普通外科雜志，2013;22(11)：1490-4.

2何曉麗，付愛麗，曹奇志，等.沉默LAIR-1表達對卵巢癌細胞增殖功能的影響〔J〕.現代免疫學，2015;35(2)：119-23.

3Yin S,Zhang J,Mao Y,etal.Vav1-phospholipase C-γ1 (Vav1-PLC-γ1) pathway initiated by T cell antigen receptor (TCRγδ) activation is required to overcome inhibition by ubiquitin ligase Cbl-b during γδT cell cytotoxicity〔J〕.J Biol Chem,2013;288(37):26448-62.

4Kim HS,Das A,Gross CC,etal.Synergistic signals for natural cytotoxicity are required to overcome inhibition by c-Cbl ubiquitin ligase〔J〕.Immunity,2010;32(2):175-86.

5Wang X,Pan J,Li J.Cytokine-induced apoptosis inhibitor 1 inhibits the growth and proliferation of multiple myeloma〔J〕.Mol Med Rep,2015;12(2):2056-62.

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11薛江楠，王春艷，張曉姝，等.腫瘤患者外周血中抑制性受體LAIR-1表達升高〔J〕.細胞與分子免疫學雜志，2008;24(4)：373-4.

〔2015-03-11修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)