左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中5-HT2A受體表達及其認知功能的影響

左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中5-HT2A受體表達及其認知功能的影響

聶磊張濤1王海燕鄒艷紅王影李春玉王禹遲瑛嬌趙塔娜趙冬梅

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯154002)

摘要〔〕目的探討左乙拉西坦(LEV)對癲癇大鼠海馬組織中5-羥色胺2A(5-HT2A)受體動態表達及對認知功能的影響。方法108只Wistar大鼠隨機分為對照組(NS)24只、正常給藥組(LEV)24只、癲癇模型組(Li-PILO)30只、癲癇給藥組(Li-PILO+LEV)30只，分別給予LEV組和Li-PILD+LEV組大鼠LEV 200 mg/kg 1次/d灌胃，連續28 d。采用RT-PCR方法分別在第7、14、28天動態檢測大鼠海馬組織中5-HT2A受體的表達，Morris水迷宮實驗測試大鼠的空間學習記憶。結果LEV與NS組5-HT2A受體表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；與NS組比較，Li-PILO組在第7天時表達水平降低，且隨時間延長降低水平越明顯，即在第14、28天5-HT2A受體表達水平明顯降低(P<0.05)；與Li-PILO型組比較，Li-PILO+LEV組5-HT2A受體在第7、14、28天表達水平明顯升高(P<0.05)。與Li-PILO組比較，Li-PILO+LEV組的逃避潛伏期明顯縮短、穿越平臺次數顯著增加(均P<0.05)。結論LEV的抗癲癇作用可能與通過上調5HT-2A受體的表達有關，其在抗癲癇的同時還可以改善大鼠的空間學習記憶。

關鍵詞〔〕左乙拉西坦；癲癇；5-羥色胺2A受體；氯化鋰-匹羅卡品

中圖分類號〔〕R742.1〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：黑龍江省衛生廳科研課題(No.2013-230)

通訊作者：張濤(1964-)，女，教授，博士，碩士生導師，主要從事抗腫瘤與抗衰老的研究。

1佳木斯大學基礎醫學院

第一作者：聶磊(1977-)，男，主治醫師，碩士，主要從事小兒神經系統疾病的研究。

癲癇是兒科常見的神經系統疾病之一〔1，2〕。許多抗癲癇藥物會使患兒的認知功能受到不同程度的損害，因此需要尋求一種既有抗癲癇作用又有腦保護作用的抗癲癇藥物。左乙拉西坦(LEV)抗癲癇機制獨特，通過與中樞神經元突觸囊泡蛋白結合而達到抗癲癇作用。LEV與突觸囊泡蛋白有很高的結合能力，結合后可以與抑制神經元異常放電，從而發揮抗癲癇的作用〔3〕。研究發現，LEV對于治療多種癲癇發作類型有顯著效果并有改善認知功能的作用〔4，5〕。本課題通過建立氯化鋰-匹羅卡品(Li-PILO)癲癇大鼠模型，初步探討LEV對癲癇大鼠海馬組織中膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和5-羥色胺2A(5-HT2A)受體表達及學習記憶功能的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組108只清潔級的Wistar大鼠(由大連醫科大學動物實驗中心提供)，體重(90±10)g，隨機分為對照組(NS)24只、正常給藥(LEV)24只、癲癇模型組(Li-PILO)30只、癲癇給藥組(Li-PILO+LEV)30只。

1.2實驗試劑和癲癇模型建立Li-PILO(Sigma公司)，LEV(UCB S.A.Belgim公司)，RT-PCR試劑盒和引物合成(北京華邁科生物技術有限公司)。動物模型的建立過程參照相關文獻〔6〕并稍有改進，將Li-PILO組及Li-PILO+LEV組大鼠先腹腔注射氯化鋰120 mg/kg，20 h后，再腹腔注射東莨菪堿1 mg/kg拮抗外周膽堿能反應，30 min后再次腹腔注射皮羅卡品80 mg/kg，并觀察大鼠的行為。大鼠的癲癇發作分級參照RACINE分級，0級：無反應或抽搐停止；Ⅰ級：面部抽動、咀嚼；Ⅱ級：面部抽動、咀嚼、點頭；Ⅲ級：面部抽動、咀嚼、點頭、前肢或后肢抽動；Ⅳ級：面部抽動、咀嚼、點頭、前肢或后肢抽動、多肢抽動或強直；Ⅴ級：全面性強直陣攣發作。在大鼠癲癇發作30 min后，立即腹腔注射地西泮(10 mg/kg)終止癲癇發作。Li-PILO+LEV組在成功建立模型后的4 h給予LEV 200 mg/kg，1次/d，連續28 d，動態觀察并分別于第7、14、28天提取海馬組織進行實驗。

1.3Morris水迷宮實驗將4組大鼠于癲癇模型建立7 d后進行實驗，共持續4 d進行定位航行實驗。空間探索實驗：于第5天進行，撤去平臺，將大鼠于水池中任意一點放入水中游泳，記錄大鼠60 s內穿越平臺的次數。

1.4RT-PCR法檢測大鼠海馬組織中5-HT2A受體的表達模型建立7、14、28 d后，分別將4組大鼠給予10%水合氯醛(0.1 ml/kg)麻醉后固定，斷頭取出海馬組織并立即放在液氮中保存。海馬組織勻漿后，加入Trizol液提取mRNA，按照試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA，將cDNA產物進行Real-time PCR循環。從NCBI庫中搜索到5-HT2A受體應用Premier5.0引物設計軟件設計引物。5-HT2A上游引物：5′GGTTTCCTT-GTCATGCCTGT 3′，下游：5′TGCAGGATTCTTTGCAGATG 3′；內參GAPDH上游：5′TGCTTCACCACCTTCTTGA 3′，下游：5′TCACCATCTTCCAGGAGCG 3′。擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.5統計學分析采用SPSS17.0軟件進行方差分析、單因素方差分析和t檢驗。

2結果

2.1觀察大鼠行為學表現匹羅卡品腹腔注射約5～10 min后，Li-PILO組和Li-PILO+LEV組大鼠出現癲癇發作，表現為面部抽動、點頭、洗臉、前肢陣攣、跌倒以至全面性強直陣攣發作，其中Li-PILO組和Li-PILO+LEV組共有9只大鼠抽搐后死亡，癲癇發作30 min后立即給予地西泮(10 mg/kg)腹腔注射終止發作，在大鼠成功建立模型后Li-PILO組和Li-PILO+LEV組大鼠表現出易激惹，并可觀察到Ⅰ～Ⅳ級的癲癇發作。

2.2LVE對認知功能的影響在定位航行實驗中，與對照組比較，Li-PILO組的逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；Li-PILO組與Li-PILO+LEV組比較，Li-PILO+LEV組的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)；LEV組和NS組比較差異無統計學意義(P>0.05)。空間搜索實驗中，與對照組比較，Li-PILO組穿越平臺的次數明顯減少(P<0.05)；與Li-PILO組比較，Li-PILO+LEV組穿越平臺次數顯著增多(P<0.05)，見表1。

表1　LEV對大鼠認知功能的影響

與Li-PILO組比較：1)P<0.05

2.3各組大鼠海馬組織中5-HT2A受體的表達NS組內各時間點5-HT2A受體表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；與NS組比較，Li-PILO組在第7天時大鼠海馬組織中5-HT2A受體表達水平降低，且隨時間延長5-HT2A受體表達水平明顯降低，即在第14、28天，5-HT2A受體表達水平明顯降低(P<0.05)；與Li-PILO組比較，Li-PILO+LEV組5-HT2A受體在第7、14、28天表達水平明顯升高(P<0.05)，見表2、圖1。

表2　海馬組織中5-HT2A受體相對表達量的

與NS組比較:1)P<0.05；與Li-PILO組比較:2)P<0.05

A：Li-PILO+LEV組；B：Li-PILO組；C：NS組；D：LEV組 圖1　PCR檢測第14天各組大鼠海馬組織中5-HT2A受體表達

3討論

癲癇是小兒時期常見的神經系統疾病之一，其特點是自發、慢性、短暫、反復發作。癲癇可引起患兒的人格障礙、記憶力減退、智力低下等表現，尤其是在患兒的發育早期影響較大〔7〕。

5-羥色胺(5-HT)是一種吲哚衍生物，是重要的神經遞質，其主要的作用有參與記憶和學習、情緒、食欲、體溫調節、心血管功能、睡眠控制、性和致幻行為、調節內分泌和抑郁以及肌肉收縮等生理功能〔8〕。5-HT2A受體是5-HT受體的亞型之一。有研究報道5-HT2A受體與神經系統疾病密切相關，Berg等〔9〕研究發現神經系統受損時腦組織中5-HT2A受體數目明顯減少。然而目前關于5-HT2A受體與癲癇的關系國內外暫無報道，而關于5-HT與癲癇的關系報道很多，5-HT在含有抑制性遞質γ氨基丁酸的神經元上表達，從而激活γ氨基丁酸，間接地發揮其抗癲癇作用。本研究提示5-HT2A受體與癲癇有密切的關系，LVE的抗癲癇機制可能是通過升高5-HT2A的表達而發揮其抗癲癇作用。認知功能包括了學習和記憶的過程。海馬是哺乳動物學習記憶的重要腦區，其損傷會導致學習記憶的障礙。癲癇發作會損傷海馬，LEV可治療癲癇，控制癲癇發作，減少海馬損傷，改善學習記憶。LEV作為治療小兒癲癇的藥物，對認知功能無影響，是一種療效好、安全性好的廣譜抗癲癇藥。何繪敏等〔10〕在左乙拉西坦對幼年癲癇大鼠空間學習記憶的影響中發現，與模型組比較，LEV組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短，LEV能夠改善大鼠的學習記憶功能。本研究結果發現，在定位航行實驗中癲癇模型組的逃避潛伏期明顯延長，以上的結果顯示LEV對癲癇大鼠的認知功能有一定的改善作用，LEV對正常大鼠空間學習記憶能力無損害作用，是安全性很好的抗癲癇藥物。

4參考文獻

1Loscher W，Brandt C.Prevention or modification of epileptogenesis after brain Insults：experimental approaches and translation research〔J〕.Pharmacol Rev，2010；62(4)：669-700.

2DiIorio CK，Bamps YA，Edwards AL，etal.The prevention research centers′ managing epilepsy well network〔J〕.Epilepsy Behav，2010；19(3)：218-24.

3Nowack A，Malarkey EB，Jia Y，etal.Levetiracetam reverses synaptic deficits produced by overexpression of SV2A〔J〕.PLoS One，2011；6(12)：1-8.

4Chung S，Wang N，Hank N.Comparative retention rates and long-term tolerability of new antiepileptic drugs〔J〕.Seizure，2007；16(4)：296-304.

5Sanchez PE，Zhu L，Verret L，etal.Levetiracetam suppresses neuronal network dysfunction and reverses synaptic and cognitive deficits in an Alzheimer′s disease model〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2012；109(42)：2895-903.

6梁益，孫紅斌.氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型研究〔J〕.實用醫學臨床雜志，2008；5(3)：112-4.

7Hermann BP，Serdenerg M，Bel B，etal.The neurodevelopmental impact of childhood onset temporal lobe epilepsy on brain structure and function〔J〕.Epilepsia，2002；43(9)：1062-71.

8Berger M，Gray JA，Roth BL.The expanded biology of serotonin〔J〕.Ann Rev Med，2009；60(1)：355-66.

9Berg KA，Harvey JA，Spampinato U，etal.Physiological and therapeutic relevance of constitutive activity of 5-HT2A and 5-HT2C receptors for the treatment of depression〔J〕.Prog Brain Res，2008；172(3)：287-305.

10何繪敏，路晴，孫香梅，等.左乙拉西坦對幼年癲癇大鼠空間學習記憶及海馬膠質原纖維酸性蛋白的影響〔J〕.兒科藥學雜志，2011；17(4)：9-12.

〔2014-05-22修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)