多烯紫杉醇對人食管癌EC-109細胞增殖及凋亡的影響

多烯紫杉醇對人食管癌EC-109細胞增殖及凋亡的影響

趙艷平楊春旭1

(呼倫貝爾職業技術學院，內蒙古牙克石021000)

摘要〔〕目的探討多烯紫杉醇對食管癌EC-109細胞株增殖、凋亡的影響。方法采用噻唑藍(MTT)比色法檢測多烯紫杉醇對EC-109細胞生長的抑制作用，采用流式細胞儀技術檢測多烯紫杉醇對EC-109細胞周期和細胞凋亡的影響，Western印跡法測定多烯紫杉醇對EC-109細胞蛋白激酶B(Akt)-1蛋白表達的影響。結果多烯紫杉醇各濃度組A值均低于陰性對照組(P<0.05)；各濃度組的早、晚期凋亡率與陰性對照組比較均增高(P<0.05)，除0.01 nmol/L組外，各組隨著濃度的增高其早、晚期的凋亡率也升高；低濃度(0.01 nmol/L)多烯紫杉醇處理的細胞阻斷G2/M期短暫、不完全，而高濃度(10 nmol/L)多烯紫杉醇對食管癌細胞的G2/M期阻斷較低濃度的完全、持久；多烯紫杉醇各濃度組處理的EC-109細胞Akt-1蛋白條帶灰度值與空白對照組比較顯著減弱，說明對其表達具有明顯抑制作用，其中10 nmol/L組最強，抑制率為85%，0.01 nmol/L較弱。結論多烯紫杉醇對人食管癌EC-109細胞的生長有明顯的抑制作用，使細胞分裂阻滯于G2/M期，并誘導腫瘤細胞凋亡。

關鍵詞〔〕多烯紫杉醇；食管癌；增殖；細胞周期

中圖分類號〔〕R73〔文獻標識碼〕A〔

1內蒙古林業總醫院內蒙古民族大學第二臨床醫學院

第一作者：趙艷平(1978-)，女，碩士，高級講師，主要從事藥理學研究。

食管癌是常見惡性腫瘤之一，早期轉移和術后復發成為食管癌高死亡率的主要原因。食管癌是一種涉及癌基因過表達、抑癌基因缺失、突變的多基因異常疾病〔1〕。多烯紫杉醇(TxT)屬于植物堿類藥物，是一種新型抗癌藥物，對實驗性動物腫瘤具有明顯的抗腫瘤作用，其可直接誘導細胞凋亡〔2〕。目前多烯紫杉醇已作為化療藥物單獨或與其他化療藥物聯合應用于臨床，主要治療乳腺癌、肺癌等，療效好，不良反應較少〔3〕。多烯紫杉醇治療食管癌的相關報道較少。本研究觀察不同濃度多烯紫杉醇對體外培養食管癌EC-109細胞株增殖活性、細胞周期及細胞凋亡的影響。

1材料與方法

1.1材料RPMI1640培養基(Gibco公司，美國)；胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)；噻唑藍(MTT)和碘化丙啶(PI)；熒光染料(Sigma公司，美國)；兔抗人Fas抗體、兔抗人增殖細胞核抗原(PCNA)抗體和SP試劑盒(北京中山金橋生物技術有限公司)，酶標儀(ELX800uV型，Bio-Tek公司)，FACSVantage SE型流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2細胞株人食管癌EC-109細胞株由中國醫學科學院腫瘤研究所建系，本實驗室凍存。接種細胞于含15%胎牛血清的RPMI1640完全培養液中，培養瓶放置于37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度培養箱中。

1.3MTT法測定多烯紫杉醇對EC-109細胞增殖的影響取對數生長期的EC-109細胞和正常人外周血單個核細胞，接種于96孔培養板中，每孔滴加200 μl單細胞懸液，使每孔含量1.4×103個細胞，設8個復孔，同時接種6個96孔板，常規培養16 h后，實驗組加入終濃度分別為0.01、0.10、1.00和10.00 nmol/L的多烯紫杉醇，空白對照組只加培養液不加細胞作為比色時調零用。分別在常規培養20、40和60 h后取出2個培養板每孔滴加MTT溶液(5 g/L)20 μl，37℃培養箱中孵育4 h后終止培養。去除孔內上清液，每孔滴加DMSO 200 μl,振蕩15 min。用酶標儀在570 nm處測定各孔吸光度(A值)，記錄結果，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率計算公式，增殖抑制率(%)=(1-實驗組A/對照組A)×100%。

1.4流式細胞術測定多烯紫杉醇對EC-109細胞凋亡的影響取對數生長期EC-109細胞，不同濃度(0.01、0.10、1.00和10.00 nmol/L)多烯紫杉醇作用48 h。每隔20 h取出不同藥物濃度細胞，收集細胞分別放入4個離心管內標記后進行離心，制成細胞濃度為1×109個/L的單細胞懸液離心后棄上清液緩慢加入預冷70%無水乙醇7 ml，4℃過夜。采用PI單染法，以10%雞紅細胞作內參標準，與樣品同步染色，每份樣品中加入1 ml PI染液，在4℃避光孵育30 min。用488 nm氬離子激光器激發由630 nm帶通濾光片接收，通過散點圖收集10 000個細胞，分析PI熒光直方圖上凋亡細胞百分率。

1.5流式細胞儀檢測細胞周期用4℃預冷PBS洗滌細胞，2 000 r/min離心5 min，收集并調整細胞濃度為1×109/L；制備的細胞懸液用體積分數為70%乙醇固定，4℃保存，染色前用PBS洗去固定液；陰性對照組加入500 μl PBS；其他藥物組分別加入100 μl RNase37℃水浴30 min；再加入400 μl PI染色混勻，4℃避光孵育30 min；上機檢測時細胞懸液用200目篩網過濾1次，記錄激發波長為488 nm處紅色熒光。實驗重復3次。

1.6Western印跡檢測EC-109細胞蛋白激酶B(AKT-1)蛋白表達以1×106個/孔細胞密度接種EC-109細胞，待細胞貼壁后，加入不同濃度多烯紫杉醇作用48 h，同時設置未加藥物的陰性對照組，提取各組細胞總蛋白，檢測蛋白濃度，經PAGE電泳后轉膜，脫脂奶粉封閉，使用一抗，4℃孵育過夜，后加入二抗，4℃輕輕振搖2 h后洗二抗，顯影、定影、洗片。GAPDH作陰性對照。

1.7統計學方法應用SPSS17.0行ANOVA方差分析和LSD-t檢驗。

2結果

2.1不同濃度多烯紫杉醇對EC-109細胞增殖的抑制作用MTT實驗結果顯示，用各劑量組的平均A值表示細胞增殖情況及抑制率(表1)，多烯紫杉醇各個濃度組A值均低于空白對照組(P<0.05)；隨著藥物劑量的增加，細胞的存活率下降，增殖抑制作用增強，呈明顯的劑量-效應關系。

表1　不同濃度多烯紫杉醇作用48 h對

與空白對照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

2.2不同濃度多烯紫杉醇對EC-109細胞的凋亡影響各濃度組的早、晚期凋亡率與空白對照組比較均增高(P<0.05)，除0.01 nmol/L組外，各組隨著濃度的增高其早、晚期的凋亡率也升高(表2)。

表2　不同濃度多烯紫杉醇對EC-109細胞的

2.3不同濃度多烯紫杉醇對EC-109細胞周期的影響無論低濃度的多烯紫杉，還是高濃度的多烯紫杉醇均可將EC-109細胞阻滯于G2/M期。低濃度(0.01 nmol/L)多烯紫杉醇處理的細胞阻斷G2/M期短暫、不完全，而高濃度(10.00 nmol/L)多烯紫杉醇對食管癌細胞的G2/M期阻斷較低濃度的完全、持久，濃度愈高這種作用愈明顯(表3)。

表3　不同濃度多烯紫杉醇作用48 h后對

2.4不同濃度多烯紫杉醇對EC-109細胞Akt-1蛋白的影響0.01、0.10、1.00及10.00 nmol/L多烯紫杉醇組處理的EC-109細胞Akt-1蛋白條帶灰度值,分別為87.01±1.09、76.07±1.03、63.02±1.01及30.01±1.02，空白對照組比較顯著減弱〔(10.01±1.02)，P<0.05〕，說明對其表達具有明顯抑制作用，其中10.00 nmol/L組最強，抑制率為85%，0.01 nmol/L較弱。

3討論

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國食管癌的類型主要是鱗狀細胞癌，約占全部食管癌的90%〔4〕。已有〔5,6〕研究表明，腫瘤的發生與細胞的過度增殖、凋亡不足有關。凋亡細胞的DNA分子發生斷裂，分子量小的DNA片段穿過細胞膜丟失，分子量大的片段形成一個DNA含量小于二倍體的區域，在流式細胞儀檢測中形成位于G0/G1峰之前的G1峰，由于壞死的細胞檢測不出現此峰，故此峰被稱作凋亡峰，凋亡峰的高度和寬度與凋亡細胞的數量成正比〔7,8〕。

細胞凋亡是在免疫系統中保證在胸腺發育過程適當去除自身免疫性T細胞和T細胞，以及下調對抗原的外周免疫應答的一種動態平衡〔9,10〕。因此T細胞凋亡是誘導中樞和外周耐受及預防自身免疫的重要過程。外周的自身免疫T細胞主要通過受體介導的活化誘導凋亡清除，而這一清除過程需要將細胞抗凋亡狀態轉變成促進凋亡狀態，這一過程又被細胞因子、死亡受體及凋亡蛋白調控〔10,11〕。細胞凋亡主要通過受體介導的活化誘導凋亡通路和內在的線粒體依賴通路激活，這兩種通路最后共同激活半胱氨酸酶瀑布樣反應從而終止免疫反應促使細胞凋亡〔12,13〕。本研究結果顯示，不同的濃度對細胞抑制增殖的程度大小有差異，同一時間藥物的劑量越大對細胞的抑制增殖作用越明顯，存在明顯的劑-效關系。多烯紫杉醇的濃度在0.01 nmol/L以上就可抑制EC-109食管癌細胞的生長，濃度大于10.00 nmol/L時幾乎完全抑制了EC-109食管癌細胞的集落形成。這提示多烯紫杉醇對EC-109食管癌細胞的抑制作用具有明顯的濃度依賴性。本研究顯示多烯紫杉醇能夠干擾細胞周期，誘導細胞凋亡，具有濃度差異，其中以10.00 nmol/L組效果最明顯，提示多烯紫杉醇對人食管癌EC-109細胞的生長有明顯的抑制作用，能使細胞分裂阻滯于G2/M期，并誘導腫瘤細胞凋亡。

4參考文獻

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〔2014-05-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)