麥冬多糖-1對心肌缺血再灌注大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞與缺血修飾白蛋白變化的影響

麥冬多糖-1對心肌缺血再灌注大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞與缺血修飾白蛋白變化的影響

李霞

(濰坊市第二人民醫(yī)院 保健科，山東濰坊261041)

摘要〔〕目的探討麥冬多糖(MDG)-1對心肌缺血再灌注大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞與缺血修飾白蛋白變化的影響。方法選取Wistar大鼠34只，其中心肌缺血再灌注造模成功19只隨機(jī)分成兩組，陰性對照組9只，予以混合飼料和純凈水飼養(yǎng)；治療組10只，在陰性對照組的飼養(yǎng)基礎(chǔ)上，按每天劑量為20 mg/kg MDG-1進(jìn)行灌胃；正常對照組10只，為未造模的正常大鼠，予以混合飼料和純凈水飼養(yǎng)，由大鼠自行飲食。飼養(yǎng)1 w后麻醉狀態(tài)下抽取心室血進(jìn)行鏡下內(nèi)皮祖細(xì)胞計數(shù)；抽取耳緣靜脈血采用白蛋白鈷結(jié)合(ACB)試驗法測定缺血修飾白蛋白；抽完血后處死大鼠，鏡下觀察心肌梗死區(qū)心肌組織病理學(xué)變化。結(jié)果①心肌缺血再灌注模型大鼠血中內(nèi)皮祖細(xì)胞水平明顯高于正常對照組，經(jīng)MDG-1治療后大鼠血中內(nèi)皮祖細(xì)胞水平較未經(jīng)MDG-1治療大鼠明顯升高(P<0.05)；②心肌缺血再灌注損傷模型大鼠血中缺血修飾白蛋白含量明顯高于正常對照組(P<0.05)；而MDG-1治療后的大鼠血中缺血修飾白蛋白水平陰性對照組明顯降低(P<0.05)；③治療組和正常對照組鏡下心肌細(xì)胞明顯好于陰性對照組，陰性對照組心肌梗死區(qū)心肌細(xì)胞排列紊亂，可見大量膠原纖維形成；治療組心肌梗死區(qū)心肌細(xì)胞排列有序，幾乎與正常對照組心肌走形一致。結(jié)論MDG-1能夠明顯提高心肌缺血再灌注模型大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞水平，降低缺血修飾白蛋白表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)，改善心肌，對臨床具有指導(dǎo)意義，值得臨床推廣。

關(guān)鍵詞〔〕麥冬多糖-1；心肌缺血；再灌注損傷；內(nèi)皮祖細(xì)胞；缺血修飾白蛋白

中圖分類號〔〕R331.3+1〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

第一作者：李霞(1981-),女，主治醫(yī)師，主要從事心血管疾病研究。

冠心病多發(fā)于老年男性、絕經(jīng)后女性及有冠心病家族史的患者，且目前趨于年輕化〔1〕。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采取經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)、支架置入術(shù)等療法，能取得最有效的臨床效果，但由于心肌缺血一段時間后，再灌注后將導(dǎo)致缺血性心肌再次損傷，加重病情，發(fā)生心肌缺血再灌注損傷〔2〕，研究表明，相對分子量低于10 000的麥冬多糖(MOG)能夠有效對抗心肌缺血引起的血管損傷〔3〕。缺血修飾白蛋白是心肌缺血特異性指標(biāo)，能夠敏感反映心肌缺血〔4〕。內(nèi)皮祖細(xì)胞是維持正常內(nèi)皮功能并能增殖分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有修復(fù)受損的血管內(nèi)皮，改善心肌缺血再灌注損傷的血管內(nèi)皮〔5〕。本研究通過比較內(nèi)皮祖細(xì)胞與缺血修飾白蛋白變化來探討MDG-1對心肌缺血再灌注模型大鼠的影響。

1資料與方法

1.1動物6周齡Wistar雄性大鼠34只，平均體重(153±14)g，購于中國科學(xué)院上海動物中心(合格證號：D20021024),置于凈化通風(fēng)動物飼養(yǎng)房內(nèi)，室溫調(diào)至25℃，自由進(jìn)食與飲水。

1.2藥物MDG-1的提取：將麥冬(購于北京同仁堂)水煎，煮沸30 min，水煎3次，3次水煎液合并煎液，濃縮，沉淀。將沉淀物進(jìn)行超濾，留取分子量<10 000的超濾液，繼續(xù)濃縮、沉淀，將沉淀干燥即為MDG糖，用瓊脂糖凝膠將MDG進(jìn)行離子交換，把水洗脫液收集、凍干，加入葡聚糖凝膠，用水洗脫，采用高效凝膠滲透色譜法和硫酸-蒽酮進(jìn)行檢測，將單一對稱峰洗脫液收集、干燥，得到白色絮狀粉末，即為MDG-1。

1.3大鼠心肌缺血再灌注損傷模型建立將大鼠全身麻醉理想后，備皮消毒，于胸骨左側(cè)中切開皮膚，逐層分離肌肉，局部止血，撐開胸腔，剪開心包，暴露心臟，用止血鉗提起左心耳，找到冠狀動脈左前降支，采用4號手術(shù)線將冠狀動脈左前降支結(jié)扎，觀察結(jié)扎部位供血區(qū)心肌出現(xiàn)局部搏動減弱，顏色變淺，結(jié)扎30 min后解開結(jié)扎線進(jìn)行再灌注。清除大鼠胸腔氣體，縫合心包，逐層縫合皮膚，術(shù)后予以青霉素肌肉注射預(yù)防感染。

1.4分組和用藥造模24只Wistar大鼠，其中3只大鼠術(shù)后出現(xiàn)心律失常死亡，1只大鼠麻醉過敏死亡，1只大鼠手術(shù)過程中心臟缺血不耐受死亡，19只成功造模大鼠隨機(jī)分為兩組，陰性對照組9只，予以混合飼料和純凈水飼養(yǎng)；治療組10只，在陰性對照組的飼養(yǎng)基礎(chǔ)上，按每天劑量為20 mg/kg MDG-1進(jìn)行灌胃；正常對照組10只，未造模的大鼠，予以混合飼料和純凈水飼養(yǎng)，由大鼠自行飲食。三組大鼠均在適宜的相同環(huán)境下飼養(yǎng)1 w。

1.5觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1三組大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞水平測定麻醉狀態(tài)下抽取心室血30 ml，采用密度梯度離心法離出單細(xì)胞核，進(jìn)行錐蟲藍(lán)染色，鏡下觀察存活的細(xì)胞計數(shù)，將存活的細(xì)胞接種于含有100 g/L FBS的DMEM培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)瓶中未貼壁細(xì)胞，為內(nèi)皮祖細(xì)胞，于鏡下觀察三組大鼠血中內(nèi)皮祖細(xì)胞計數(shù)，并進(jìn)行生物學(xué)標(biāo)志物檢測。

1.5.2三組大鼠缺血修飾白蛋白含量測定抽取耳緣靜脈血3 ml加入含二胺基四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝劑的真空管中混勻，離心10 min后取血漿，采用白蛋白鈷結(jié)合(ACB)試驗法檢測缺血修飾白蛋白含量，試劑盒由長沙頤康科技開發(fā)有限公司提供。

1.5.3心肌組織病理學(xué)觀察抽取耳血后處死家兔，迅速取出心臟，浸泡于10%中性甲醛溶液中，固定24 h。將心肌梗死區(qū)經(jīng)常規(guī)脫水、包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察，每張切片選取3個視野，測量的數(shù)值用于統(tǒng)計分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2結(jié)果

2.1三組大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞密度和缺血修飾白蛋白含量比較正常情況下，大鼠血中內(nèi)皮祖細(xì)胞處于低水平狀態(tài)，當(dāng)心肌缺血再灌注損傷后，血中內(nèi)皮祖細(xì)胞迅速增殖，與正常對照組〔(1.02±0.14)×107/ml〕相比存在明顯差異(P<0.05)；治療組內(nèi)皮祖細(xì)胞水平〔(8.84±2.47)×107/ml〕明顯高于陰性對照組〔(43.4±0.26)×107/ml〕(P<0.05)； 三組大鼠中，陰性對照組大鼠血中缺血修飾白蛋白含量〔(64.15±9.43)U/ml〕明顯高于正常對照組〔(27.38±3.94)U/ml〕及治療組〔(31.58±7.64)U/ml〕(P<0.05)。見圖1。

圖1　三組大鼠血中內(nèi)皮祖細(xì)胞(HE染色，×200)

2.2心肌組織病理學(xué)觀察陰性對照組和治療組大鼠心肌梗死區(qū)以及周圍組織鏡下未見多核肌細(xì)胞生長，治療組和正常對照組大鼠心肌明顯好于陰性對照組，陰性對照組大鼠心肌梗死區(qū)心肌細(xì)胞排列紊亂，可見大量膠原纖維形成；治療組大鼠心肌梗死區(qū)心肌細(xì)胞排列有序，幾乎與正常對照組大鼠心肌走形一致。見圖2。

圖2　三組大鼠心肌組織(HE染色，×200)

3討論

冠心病是冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致器官病變常見類型。40歲以后患者發(fā)作時易出現(xiàn)致殘、致死的嚴(yán)重后果〔6〕。冠狀動脈旁路移植術(shù)是目前臨床治療冠心病最有效的手段，但是心臟經(jīng)過一段時間缺血后，再次灌注血液后將會加重心肌缺血性損傷，心肌缺血再灌注損傷是冠狀動脈旁路移植術(shù)后使缺血的心肌重新獲得血液供應(yīng)造成損傷和手術(shù)過程中造成的心肌損傷的總稱〔7〕。心肌缺血再灌注損傷以心律失常、心肌頓挫和心肌再灌注損傷的病理狀態(tài)為表現(xiàn)形式，心律失常和心肌頓挫為可逆性心肌損傷，而心肌再灌注損傷是不可逆病理改變，為最嚴(yán)重的心肌缺血狀態(tài)〔8〕。研究表明〔9〕，麥冬具有清心除煩、益胃生津和養(yǎng)陰潤肺的功效，從麥冬中提取的MDG具有抗心肌缺血損傷作用，特別是相對分子量小于10 000的MDG-1表現(xiàn)最

為明顯。

本研究結(jié)果說明心肌缺血刺激骨髓對內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖分化，使機(jī)體能以最短的時間修復(fù)損傷的心肌，恢復(fù)心肌正常功能。MDG-1在心肌缺血時與機(jī)體起到協(xié)同作用，刺激機(jī)體對內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖，使心肌得到最大程度的恢復(fù)，這可能與MDG-1能夠增強(qiáng)垂體腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)作用有關(guān)〔10〕；缺血修飾白蛋白是心肌缺血特異性指標(biāo)，能夠敏感反映心肌缺血程度。本實驗結(jié)果說明MDG-1能夠增強(qiáng)心肌對缺血的適應(yīng)能力，提高心肌對缺血缺氧的耐受能力，增加冠脈流量，保護(hù)缺血區(qū)的心肌細(xì)胞，并能改善心律失常和心肌的收縮能力〔11〕；從而使經(jīng)MDG-1治療后的大鼠心肌損傷程度明顯未經(jīng)治療的缺血再灌注大鼠，這在心肌組織病理學(xué)觀察的結(jié)果中也得到證實。

綜上所述，MDG-1能夠增強(qiáng)心肌對缺血缺氧的耐受能力，增加冠脈流量，保護(hù)缺血的心肌細(xì)胞并能與機(jī)體協(xié)同促進(jìn)心肌缺血再灌注大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和分化，降低血中缺血修飾白蛋白含量，最大程度的修復(fù)缺血損傷的心肌，恢復(fù)心臟功能。但本研究對象為動物，對于MDG-1對心肌缺血再灌注的影響還需要臨床中進(jìn)一步大樣本臨床研究。

4參考文獻(xiàn)

1Bittl JA.Advances in coronary angioplasty〔J〕.N Engl J Med,1996;335:1290-302.

2Yalonetsky S,Horlick EM,Osten MD,etal.Clinical characteristics of coronary artery disease in adults with congenital heart defects〔J〕.Int J Cardiol,2013;164(2):217-20.

3徐德生,馮怡,林曉,等.麥冬多糖MDG-1的分離純化和結(jié)構(gòu)分析〔J〕.藥學(xué)學(xué)報,2005;40(7):636-9.

4李萍,王化芬,崔慶,等.缺血修飾白蛋白的檢測在急性冠脈綜合征早期診斷中的意義〔J〕.臨床軍醫(yī)雜志,2008;36(5):684-5.

5肖海波,梅舉,黃盛東,等.血管內(nèi)皮生長因子基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞移植于大鼠缺血心肌的研究〔J〕.臨床心血管病雜志,2007;23(3):184-7.

6Garekar S,Paules MM,Reddy SV,etal.Is it safe to perform cardiac catheterizations on adults with congenital heart disease in a pediatric catheterization laboratory〔J〕?Catheter Cardiovasc Interv,2005;66(3):414-9.

7馮曉東,張順業(yè),王海曙，等.非體外循環(huán)不停跳冠狀動脈旁路移植術(shù)220例分析〔J〕.中國藥物與臨床,2006；6(2):140-1.

8Araujo-Pradere EA,Buresova D,Fuller-Rowell DJ,etal.Initial results of the evaluation of IRI hmF2 performance for minima 22-23 and 23-24〔J〕.Adv Space Res,2013;51(4):630-8.

9徐德生,馮怡,周躍華,等.麥冬多糖中抗急性心肌缺血活性部位研究〔J〕.中成藥,2004;26(10):832-7.

10Wang S,Zhang Z,Lin X,etal.A polysaccharide,MDG-1,induces S1P1 and bFGF expression and augments survival and angiogenesis in the ischemic heart〔J〕.Glycobiology,2010;20(4):473-84.

11鄭琴,馮怡,徐德生,等.麥冬多糖MDG-1對鼠實驗性心肌缺血的保護(hù)作用〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2007;27(12):1116-20.

〔2014-10-25修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)