雙咪唑硝基衍生物配合物的合成及其生物活性研究

·化學與化學工程·

雙咪唑硝基衍生物配合物的合成及其生物活性研究

楊莉寧1,黑嘉慧2,李立1,成昭1,余麗麗1

(1.西安醫學院 藥學院，陜西 西安710021;2.陜西航天職工大學，陜西 西安710100)

摘要：以2-甲基-4-硝基咪唑為原料按照文獻方法合成了1,2-二[1-(2-甲基-4-硝基咪唑)]乙烷配體,進而制備了其銅、銀配合物,通過紫外吸收光譜、熒光光譜及黏度法研究所合成的有機配體及其配合物與DNA相互作用模式,并以二倍稀釋法研究抗厭氧菌的活性。結果表明，目標化合物與DNA相互作用方式可能為部分插入,并伴隨有靜電式結合。Cu，Ag配合物對兩種厭氧菌菌株的抗菌性相對配體明顯增強。

關鍵詞：雙咪唑硝基衍生物;金屬配合物;與DNA相互作用;抗厭氧菌

收稿日期：2014-07-22

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81302706);陜西省教育廳自然科學基金資助項目(14JK1631);西安醫學院博士科研啟動基金資助項目(2012DOC3)

作者簡介：楊莉寧,女,陜西渭南人,副教授,從事生物無機化學及無機藥物化學方面的研究。

中圖分類號：O614

Synthesis and biological activity of complexes with flexible

bisimidazole nitro-derivative ligand

YANG Li-ning1, HEI Jia-hui2, LI Li1, CHENG Zhao1, YU Li-li1

(1. Department of Pharmacy, Medical University of Xi′an, Xi′an 710021, China;

2.Shaanxi Aerospace Staffs & Vocation University, Xi′an 710100, China)

Abstract:A flexible nitroimidazole derivative 1,2-di-[1-(2-methyl-4-nitroimidazolyl)] ethane was prepared according to the literature method, and its transition metal complexes were synthesized. The binding of the compounds with calf thymus DNA has been investigated by UV, fluorescence spectra and viscosity measurements. With the two-fold agar dilution method, the antiamoebic activities of nitroimidazole derivative and its copper, silver complexes have been determined, respectively. All of the results indicate that the ligand and complexes bind to DNA base pairs by partial intercalation and electrostatic attraction mode. Complexes have better effect of antiamoebic activity than ligand to two kinds of anaerobic bacteria strains.

Key words: flexible bisimidazole nitro-derivative; metal complex; DNA-binding; antiamoebic activity

硝基咪唑類藥物是常見的抗厭氧菌類藥物,尤其甲硝唑藥物在臨床上的應用非常廣泛。但是，隨著時間的推移,細菌的耐藥性迅速增加,藥物的毒副作用也突顯出來,因而對硝基咪唑類藥物的構效關系的研究日益深入。對金屬配合物藥物的抗菌性研究,為近年來生物無機化學的熱門研究課題之一。目前這一方面的研究主要集中于Schiff堿過渡金屬配合物[1],對硝基咪唑類藥物配合物的抗厭氧菌活性的研究相對較少。本研究采用經典的二倍稀釋法藥物敏感實驗原理,初步分析了新合成的硝基雙咪唑衍生物及其銅、銀配合物對兩種厭氧菌變異鏈球菌(Streptococcus mutans)和伴放線放線桿菌(aggregatibacter actinomycetem)的體外抗菌活性,為進一步探討硝基咪唑類藥物的抗厭氧菌機理提供了豐富的實驗素材。

1實驗部分

1.1試劑與儀器

除小牛胸腺DNA(ct-DNA)為生化試劑,2-甲基-4-硝基咪唑為化學純外,其他試劑均為分析純。

德國Vario EL-IIIG型元素分析儀,EQUINOX55 型紅外光譜儀,STA449C型熱分析儀;日本1800紫外可見分光光度計,F-4500熒光分光光度計;上海Ubbeoldhe黏度計,DDS-307型電導儀。

1.2 配體及配合物的合成

配體1,2-二[1-(2-甲基-4-硝基咪唑)]乙烷(以下用L表示)的合成參照文獻[2-3]。

其合成路線為:

配合物[Cu(L)Cl2]·H2O(1)的合成：準確稱取配體 0.140g(0.5mmol)于25mL燒杯中,加入10mL甲醇和5mL乙腈略微加熱溶解得橙黃色溶液。再稱取CuCl2·2H2O 0.091g (0.5mmol)于50mL燒杯中,加入10mL甲醇溶解,待完全溶解后,將配體溶液逐滴滴入CuCl2溶液中得到黃綠色溶液,持續攪拌3天,有藍綠色粉末狀沉淀析出,過濾,洗滌,固體粉末烘干后呈藍綠色。

配合物[Ag(L)NO3](2)的合成方法與配合物(1)相似,但要避光攪拌3天,得粉色沉淀物。

1.3配體及配合物與DNA相互作用實驗

采用已報道文獻[4-5]的經典方法配制實驗所需試劑、緩沖溶液以及進行與DNA相互作用實驗操作。DNA濃度對化合物的紫外吸收光譜和熒光吸收強度的影響見圖2，3,化合物濃度對DNA黏度的影響見圖4。

1.4 配體及其配合物體外抗厭氧菌活性實驗[6]

1.4.1實驗材料實驗所用標準菌株:變形鏈球菌(StreptococcusmutansUA159), 伴放線放線桿菌(ActinobacillusactinomycetemATCC 29523),均來自第四軍醫大學口腔醫院牙體實驗室。

1.4.2實驗方法

1) 培養基的準備

稱取37g培養基,加入950mL的三蒸水,加熱溶解,再補水至1L,在121℃下高壓滅菌15min,冷卻至4℃保存。給所制備的1L培養液中加入15g瓊脂粉,充分溶解后,高溫高壓消毒15 min,再冷卻至50℃,取約20mL均勻地鋪于培養皿中,常溫下冷卻,并于4℃保存。

2) 抗菌活性檢測

取凍存的變形鏈球菌(S.mutans)和伴放線放線桿菌(A. a)分別劃線接種于培養基表面,進行厭氧培養;挑取培養36 h的S.mutans和培養48 h的A. a菌落各自接種于培養液,其中前者培養24 h,后者培養48 h,備用。用少量DMSO配制各種配體及其Cu，Ag配合物待測抗菌劑,用無菌水對各種抗菌劑從1 280 mg/L到0.625 mg/L進行2倍梯度稀釋;96孔板的每孔中分別加入上述各種濃度的待測抗菌劑溶液、細菌培養液和BHI培養液,用酶標儀進行OD值測定。取對照組(每孔以 PBS緩沖溶液代替待測抗菌劑溶液,其余同前) 100μL,進行10倍梯度稀釋,取100μL稀釋的菌液鋪于BHI培養基表面,培養48 h,得到每孔中原細菌生存數(同時對3個復孔進行計數,取平均值)。再于厭氧箱中培養24 h。培養后,繼續測定OD值,得到最小抑菌濃度(MIC)值。所有的試樣均平行測試3次,取平均值。

2結果與討論

2.1配合物的性質表征

1) 配合物的元素分析和摩爾電導率

表1　配合物的元素分析及摩爾電導率

2) 配體及配合物的紅外光譜分析

表2　配體及配合物的紅外光譜數據(cm -1)

由表2可見,配體形成各配合物后的特征吸收峰發生偏移的主要表現在咪唑環上的振動吸收,其中的υC=N伸縮振動都向低波數發生了偏移,說明金屬與咪唑環上的3位N發生了配位[8]。配合物(2)存在含氧酸根NO3-,在譜圖上表現為4條譜帶,尤其是NO3-的N-O伸縮振動峰在整個譜圖的吸收峰是最強的,其指紋區譜帶未增加,說明NO3-未參與配位。

采用元素分析、紫外、紅外、電導率等方法,結合雙咪唑配合物文獻[9-10],初步推測各配合物的可能結構為圖1所示。

圖1　配合物(1)，(2)的可能結構 Fig.1　The possible structure of the complexes

2.2配合物與ct-DNA相互作用研究

1) 配體及其配合物與DNA相互作用的紫外光譜分析

圖2為配體及其配合物(1)，(2)隨著DNA濃度增加與DNA相互作用的紫外吸收光譜圖。

曲線a→f DNA濃度(×10 -5mol/L)分別為: 0; 1.59; 3.16;4.71; 6.23; 7.74, 以下熒光圖同 圖2　DNA濃度對配體L及其配合物紫外光譜的影響 Fig.2　UV absorption spectra of L and its complexeswith increasing concentration of DNA

由圖2可以看到,雙咪唑硝基衍生物配體L及其銅配合物隨著DNA濃度的增加,其紫外特征吸收峰表現為減色效應,而它的銀配合物則表現為增色效應,最大吸收峰未發生明顯的紅移或藍移,與DNA相互作用模式應該不是典型的插入作用[11]。根據減色率的大小,DNA對銅配合物的紫外光譜的影響比配體的紫外光譜影響要大。如果化合物小分子紫外-可見吸收光譜中的吸收峰強度表現為增色效應或減色不顯著、無紅移現象,則認為化合物小分子與DNA發生了非插入的靜電作用或溝槽作用[12]。

2) 配體及其配合物與DNA相互作用的熒光光譜分析。

圖3為配體及其配合物隨著DNA濃度增加與DNA相互作用的熒光吸收光譜圖。

圖3　DNA濃度對配體L及其配合物熒光光譜的影響 Fig.3　Fluorescence spectra of L and complexes at different concentrations of DNA

如圖3所示,隨著DNA濃度的不斷增加,配體及其配合物的熒光光譜強度都呈增加的趨勢,但最大熒光吸收峰值變化不大,因此配體及其配合物與DNA的作用模式可能不是典型的插入式。根據增色率大小,配體及其銅配合物與DNA的作用力要強,這與根據紫外吸收強度變化所得到的結論基本一致。

3) 配體及其配合物與 ct-DNA 相互作用的黏度分析

黏度法是研究化合物與DNA相互作用模式的另一種有效的檢測方法[13]。當配合物插入DNA之間,黏度增加;與DNA以部分插入方式作用時,DNA黏度變小;DNA溶液黏度變化不大,則與DNA以非插入方式作用[14-18]。如圖4所示,配體L及其銅配合物(1)使DNA溶液黏度減小,說明配體L與DNA相互作用方式可能為部分插入;而其銀配合物(2)使DNA黏度變化不大,則可能是以非插入方式與DNA相互作用,這些結果與光譜分析的結果是一致的。

2.3配體及其配合物抗厭氧菌活性研究

對所合成的硝基雙咪唑衍生物配體及其Cu，Ag 配合物應用變異鏈球菌(S. mutans)和伴放線放線桿菌(A. a)進行抗菌活性試驗,測試結果如表3所示。結果表明,參與抑菌實驗的所有藥物對伴放線放線桿菌(A. a)的抑菌效果要強于變異鏈球菌(S. mutans)。配體L對兩種菌的抑菌效果都不如其配合物明顯,對變異鏈球菌(S. mutans)抑菌性(2)>(1),而對伴放線放線桿菌(A. a)的抑菌性(1)>(2)。

圖4　配體L及其配合物濃度對DNA黏度的影響 Fig.4　Effects of increasing amount of L and complexes on the viscosity of DNA

表3化合物對S. mutans UA 159和A. a ATCC 29523的最小抑菌濃度MIC值

Tab.3MIC of test material on S. mutans UA 159 and A. a ATCC 29523

測試樣MIC(S.mutans)/μg·mL-1MIC(A.a)/μg·mL-1L-320-160Ag配合物(2)40-2040-20Cu配合物(1)320-16020-10Ag+20-101.25-0.625Cu2+-20-10

硝基咪唑類藥物發揮抗厭氧菌作用,是在細胞中的硝基還原酶的作用下,藥物的硝基還原成羥胺衍生物后,再與DNA作用引起鏈損傷、斷裂、解旋,導致細菌死亡[19-20]。依據硝基咪唑類藥物的抗菌機制,可以認為硝基咪唑類藥物抗厭氧菌的最終主要細胞內靶點為DNA。分析配體及其配合物與DNA之間相互作用的實驗結果,其抗菌性與DNA相互作用結果并不完全一致,這是因為金屬配合物的抑菌機理較復雜,包括干擾細胞的呼吸過程,破壞蛋白質的合成,進而抑制微生物的生長;正常的細胞生長過程受到配合物C=N基團與細胞活性中心間所形成氫鍵的影響等等。因此，配合物的抗厭氧菌活性并不完全受該藥和DNA作用結果的影響。金屬配合物的抗厭氧菌機理,以及抗菌活性和配合物與DNA相互作用之間的關系,還需要進一步分析研究。

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(編輯任智卉)