LC—MS同時測定大鼠腦脊液中谷氨酸和y一氨基丁酸的方法研究

摘要：建立LC-MS同時檢測大鼠腦脊液中谷氨酸和y一氨基丁酸的方法。采用安捷倫ZORBAX SIL（ 4.6 mm×250mmx5μm）硅膠正相色譜柱，流動相為甲醇一水（O.l%甲酸）=50：50（v/v），梯度洗脫，流速為1mUmin。電噴霧離子源（eletmspray ionization，ESI）采用正離子化方式，以多重反應檢測（multiple reaction monitoring，MRM）方式進行檢測，用于定量分析的離子反應分別為，77/2 148.1--m/z 84.1（谷氨酸，[M+H]+），m /z 104.1一m/z 87.1（y一氨基丁酸，[M+H]+）。測定大鼠腦脊液中谷氨酸在500～2500IJg/L和y一氨基丁酸在50～250卜Lg/L質量濃度范圍內，濃度與峰面積呈良好的線性關系。該方法簡便、準確、靈敏度高，專屬性強，重復性好，適用于腦脊液中谷氨酸和y一氨基丁酸的同時測定，可為氨基酸類神經遞質提供有效的檢測手段。

關鍵詞：液質聯用法；谷氨酸；y-氨基丁酸；腦脊液

文獻標志碼：A

文章編號：1674-5124（ 2015） 02-0050-04

引 言

氨基酸類神經遞質是人類腦組織中最重要的神經遞質，包括興奮性及抑制性兩類。其中，谷氨酸（Glu）是興奮性神經遞質，y一氨基丁酸（GABA）是抑制性神經遞質。存在于腦組織和腦脊液中的這些氨基酸類神經遞質，對于調節機體生理活動具有重要作用，其含量及比例的變化伴隨著多種中樞神經系統疾病的發生。因此，氨基酸含量的檢測對于某些疾病的篩查、診斷和治療具有重要意義。

目前，測定氨基酸類神經遞質的常用方法是高效液相色譜法（HPLC）和氨基酸自動分析儀法。但是由于氨基酸無紫外吸收，需要柱前衍生才能進行檢測，操作步驟繁瑣，耗時耗力；并且柱前衍生會使得氨基酸的測定結果存在不確定性。本文采用液相色譜一質譜聯用（LC-MS）技術，建立了對大鼠腦脊液中兩種氨基酸類神經遞質快速同時分析的方法。該方法的重現性好，靈敏度和選擇性高，測定較為準確，分析步驟簡單，提高了分析效率。可應用于腦組織中氨基酸類神經遞質的分析測定，為臨床檢測提供可靠的技術手段。

1.儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1260 series）；液質聯用儀（6410B.安捷倫三重串聯四級桿質譜）；電子天平（CP225D，德國賽多利斯公司）；氮吹儀（MTN-2800D，天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；超純水儀（RIOs5.密理博中國有限公司）；旋渦混合器（XW-80A，上海青浦瀘西儀器廠）；離心機（TGL-16G，上海安亭科學儀器）。

1.2 材料

Glu（批號：100023-198601）、GABA（批號：100023-198601）均由中國藥品生物制品檢定所提供。色譜級甲醇、乙腈購白賽默飛世爾公司，其他試劑為市售分析純。超純水自制。

1.3 實驗動物

SPF級雄性大鼠6只，由四川省中醫藥科學院實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（川）2008-19。

2.方法

2.1 色譜條件

安捷倫ZORBAX SIL（4.6 mmx250mmx5μm）硅膠正相色譜柱；流動相甲醇一水（0.1%甲酸）=50：50（v/v），梯度洗脫系統如表l所示，流速為1 mL/min，柱后分流，分流比為1：3，進樣量為2μL，柱溫40℃。

2.2 質譜條件

安捷倫三重串聯四級桿質譜，干燥氣為氮氣，干燥氣溫度：350℃，干燥氣流速：11L/min.電噴霧離子源（ESI），毛細管電壓：4kV，霧化氣壓力：40 psi（lpsl=6.895 KPa），裂解電壓：75V，離子化方式為正模式。碰撞能量：15 V（谷氨酸）、10V（y一氨基丁酸），碰撞池加速電壓：3V，檢測方式為多重反應監測（MRM）方法，用于定量分析的離子反應分別為， m/Z148.1一m/z 84.1（谷氨酸，[M+H]+），m/z 104.1—m/z 87.1（y一氨基丁酸，[M+H]+）。

2.3 樣品溶液的制備

體外穿刺抽取大鼠腦脊液約100μL，按照1：4（v∶v）加甲醇沉淀蛋白，充分振蕩混合，離心20 min（轉速12 000 r/min）.取上層清液用氮吹儀吹干，加0.4mL流動相B互溶，離心lOmin（轉速12000r/min）后取上清液待測。

2.4 對照品溶液的制備

由于腦積液中存在內源性的Glu和GABA.無空白樣本，故精密稱取Glu對照品與GABA對照品各5 mg，流動相B定容到10mL，再分別取200μL流動相B定容到10mL，配成質量濃度為10mg/L的對照品儲備液。分別取250，500，750，1000，1250μL Glu（10mg/L）與25，50，75，100，125μL GABA（lOmg/L）至5 mL容量瓶中，流動相B定容，得到質量濃度分別為500，1000，1500，2 000，2 5001Lg/L和50， 100， 150，200，250μg/L的系列混合對照品溶液，冷藏備用。

3.結果

3.1 方法專屬性考察

取對照品溶液和腦脊液樣品溶液按照2.1和2.2的條件，分別進樣2μL，結果Glu的保留時間約為7.9min.GABA的保留時間約為11.5min，腦脊液中的內源性成分不干擾樣品的測定（如圖1～圖4所示）。

3.2 定量限

分別取Glu和GABA對照品溶液，逐步稀釋，分別進樣2μL，當信噪比SNR=10時，得到Glu和GABA定量限質量濃度分別為8.12μg/L。

3.3 標準曲線及線性范圍

取2.4Glμ和GABA系列混合對照品溶液，分別進樣2μL，記錄Glμ及GABA峰面積，以峰面積為縱坐標，質量濃度C（μg/L）為橫坐標，進行線性回歸，得到Glu和GABA標準曲線方程分別為y=6.864x+1361.ll，r2=0.9989和y=4.333x+81.41，r2=0.9994。結果表明：Glu和GABA在500～2 500μg/L和50～250μg/L的質量濃度范圍內線性關系良好。

3.4 精密度實驗

精密量取Glu和GABA對照品貯備液適量，用流動相B稀釋成質量濃度分別為500，1 000.2000μg/L和50，100，200μg/L的標準溶液，分別進樣2μL，結果表明Glu和GABA標準樣品精密度良好（見表2和表3）。

3.5 重復性實驗

取同一大鼠腦脊液100μL，平行操作5份，按照2.3的操作進行處理，在2.1和2.2的條件下進行測定，計算GJlu和GJABA的峰面積的RSD，結果見表4。

3.6 加樣回收率實驗

取同一大鼠腦脊液5份，每份50μL。分別加入50μL Glu（5000μg/L）和GABA（600μg/L）的對照品溶液，然后再加入400μL的甲醇，充分振蕩混合，離心20min（轉速12000r/min）.取上層清液用氮吹儀揮干，加0.4mL流動相B互溶，離心10min（轉速12000r/min）后取上清2μL進樣測定，回收率結果見表5。

3.7 穩定性實驗

按2.3的方法分別制備低、中、高3個質量濃度（Glu 600，1200，2400μg/L和GABA 65，110，220μg/L）的樣品溶液，分別在室溫（放置6，12，24h）、長時間凍存（-25℃凍存l，2，3周）和凍融（凍融1，2，3次）條件下進行色譜測定，結果低、中、高3種質量濃度的RSD分別為（Glu 5.65%、4.24%、3.87%和GABA 4.39%、3.18%、3.08%）.

3.8 質量濃度測定結果

按2.3的方法制備大鼠腦脊液樣品5份，分別進樣2μL，質量濃度水平見表6。

4.結束語

文獻采用LC-MS方法測定GIμ和GABA的含量，由于GIμ和GABA為強極性化合物，反向色譜柱對此類化合物幾乎沒有保留，使得樣品出峰時間較早、基質影響較大和樣品峰未完全分離。故采用硅膠正相色譜柱，使樣品出峰時間推后到7.9～12min，避免了雜質的干擾；同時，由于使用5μm的普通液相色譜柱進行分離，為保證最佳的分離效果和質譜檢測效果，使用1mL/min流速，1：3柱后分流。在反向色譜系統中使用正相色譜柱，實現了樣品與樣品、樣品與基質間的完全分離，但較長時間使用后存在一定的柱流失，這樣會影響離子化效率，需要及時清洗。

分別考察了甲醇和乙腈組成的流動相體系，以及甲酸和乙酸的加入對樣品的離子化作用和酸加入量對樣品測定的影響。甲醇和乙腈組成的流動相體系等體積時樣品分離效果均不理想，采用梯度洗脫后均能實現樣品較好分離，從經濟性考慮，選擇甲醇作為流動相。甲酸和乙酸均能增強樣品的離子化效率，但甲酸的效果好于乙酸，同時酸的加入量比較了0.05%.0.1%，0.2%.0.3%條件下的離子化效果，最終選擇加入0.1%甲酸。

對干燥氣溫度、裂解電壓和碰撞能量等質譜條件進行了篩選，最后確定Glu和GABA的檢測干燥氣溫度為350℃，裂解電壓為75V，碰撞能量Glu為15V，GABA為10V，采用正離子模式多重反應監測（MRM）方法。

本實驗建立了高效液相色譜一電噴霧串聯質譜（LC-ESI-MS/MS）法對大鼠腦脊液中Glu和GABA的快速同時檢測方法。樣品前處理簡單，無需衍生化可以直接測定。檢測時間短，可為臨床診斷提供可靠的檢測手段，對于神經系統疾病的診斷和治療提供參考。