甘草對(duì)雄性小鼠睪丸生殖毒性的影響

甘草對(duì)雄性小鼠睪丸生殖毒性的影響

孫新明肖鶯1周劍莉楊亞軍楊贛軍胡紅梅孫弋

(井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部，江西吉安343009)

摘要〔〕目的探討甘草對(duì)雄鼠睪丸生殖毒性的影響。方法對(duì)給以甘草制劑的母鼠所產(chǎn)雄性后代及給藥雄性個(gè)體的生殖行為和配種能力、血液睪酮濃度、睪丸指數(shù)及組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)評(píng),并檢測(cè)給藥對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)及其分泌睪酮的影響。結(jié)果長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)服450 mg甘草提取物/kg體重對(duì)雄鼠的性行為和配種能力產(chǎn)生一定程度的影響，對(duì)雄性鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)及其分泌睪酮的功能有顯著影響，但存在個(gè)體差異。結(jié)論長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)服450 mg甘草提取物/kg體重對(duì)雄性小鼠有一定的生殖毒性作用。

關(guān)鍵詞〔〕甘草；生殖毒性；間質(zhì)細(xì)胞

中圖分類號(hào)〔〕R285〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(GJJ1053)；井岡山大學(xué)博士科研啟動(dòng)金項(xiàng)目(JZB11018)

1吉安市食品藥品檢驗(yàn)所

第一作者：孫新明(1968-)，男，博士，副教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合與基礎(chǔ)研究。

不孕不育癥是全球性復(fù)雜的醫(yī)學(xué)和社會(huì)學(xué)問(wèn)題之一。隨著工業(yè)的日益發(fā)達(dá)及對(duì)環(huán)境污染控制的相對(duì)不足和臨床藥物濫用對(duì)男性生殖健康日益嚴(yán)重的影響，男性因素所引發(fā)的不育不孕癥發(fā)生率越來(lái)越高而逐漸引起人們的重視〔1～3〕。長(zhǎng)期以來(lái)，甘草等植物中草藥及其復(fù)方常作為中藥材食品添加物及臨床常用藥得以廣泛應(yīng)用，甘草的主要化學(xué)成分是甘草甜素、甘草次酸。而中藥藥理學(xué)認(rèn)為，大劑量的甘草甜素有雌激素樣作用,而甘草次酸具有抑制雄性小鼠生殖腺產(chǎn)生睪酮的作用〔4〕，且近代藥理研究也發(fā)現(xiàn)，不少臨床常用的中藥如甘草、補(bǔ)骨脂等可促進(jìn)雌性動(dòng)物乳腺發(fā)育和子宮明顯增重及血清雌激素水平升高〔5〕，但其雌激素樣作用是否與環(huán)境雌激素一樣具有男性生殖毒性作用？特別是甘草對(duì)男性生殖系統(tǒng)的毒性作用目前未見(jiàn)系統(tǒng)、詳細(xì)的研究報(bào)道。鑒于此，本研究從中藥體內(nèi)給藥及研究甘草對(duì)睪丸結(jié)構(gòu)及功能的影響，同時(shí)對(duì)分離的睪丸間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外給藥研究甘草制劑對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)及其分泌睪酮功能的影響，以了解含雌激素樣作用的中草藥對(duì)睪丸的生殖毒性作用。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料清潔級(jí)BABL/c雄鼠20只(購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)；市售藥用甘草采用超聲提取法和樹(shù)脂吸附技術(shù)自制成浸膏(含甘草提取物62.5 mg/ml)后，灌服液用前以蒸餾水稀釋成給藥所需藥物濃度后經(jīng)高壓滅菌后冷卻備用，培養(yǎng)用液以PBS溶液配制成10 mg/ml藥物濃度，過(guò)濾除菌，置冰箱冷藏備用；

1.2 主要試劑DMEM、DMEM/F12、小牛血清、苔盼藍(lán)購(gòu)于Gibco公司；膠原酶、透明質(zhì)酸酶、percoll分離液、HEPEs購(gòu)于Sigma公司；胰蛋白酶購(gòu)于Amresco公司；HE染色液、PBS、D-hanks液培養(yǎng)基均為自制試劑；其他常規(guī)普通試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 體內(nèi)給藥劑量的確定及實(shí)驗(yàn)分組通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定甘草浸膏藥物高、低劑量組。預(yù)實(shí)驗(yàn)中低劑量組劑量為人類臨床實(shí)際接觸水平(臨床成人每日常用給藥量為含12 mg甘草酸的甘草劑量，換算成甘草為45 mg/kg體重)；首次設(shè)置的高劑量組劑量為低劑量組的30倍，結(jié)果若能使親代動(dòng)物出現(xiàn)輕度中毒，但不出現(xiàn)死亡或死亡率不超過(guò)10%〔6〕，則此劑量確定為高劑量組給藥劑量，否則要調(diào)節(jié)給藥劑量，直至達(dá)到要求。

確定高、低給藥劑量后，將體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分為成年雄性鼠給藥組和妊娠期母鼠給藥組。其中雄性鼠給藥組的個(gè)體為60只8周齡雄性鼠，在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)5～7 d后,隨機(jī)分為高、低劑量組和對(duì)照組各20只，各組灌胃等量溶液(給藥組每只小鼠給予相應(yīng)高、低劑量各0.4 ml藥液，給對(duì)照組小鼠每只0.4 ml生理鹽水)，每天1次，連續(xù)給藥60 d。妊娠期母鼠給藥組同樣分為高、低劑量組和對(duì)照組各20只，所有配種母鼠挑選發(fā)情雌鼠(陰門潮濕、發(fā)紅的性成熟個(gè)體)，按公母比例1∶1放入公鼠籠內(nèi)合籠交配,于次日凌晨7～8點(diǎn)檢查白色陰道栓者為懷孕鼠，該天記為懷孕第1天，于妊娠 第6天開(kāi)始直至產(chǎn)仔后斷奶期間給妊娠母鼠灌胃給藥。在每組給藥妊娠母鼠所產(chǎn)雄性仔鼠中隨機(jī)選取20只，正常飼養(yǎng)至性成熟后與給藥雄性鼠同樣與成年雌鼠交配，并檢測(cè)以下指標(biāo)。

1.3.1 性行為及配種能力的觀察每只實(shí)驗(yàn)雄鼠按上述方法與發(fā)情雌鼠合籠交配,觀察雄性小鼠的性行為(主要是追逐與爬跨母鼠)。于次日凌晨7～8點(diǎn)檢查有白色陰道栓者為懷孕鼠,該天記為懷孕第1天，飼養(yǎng)懷孕鼠至產(chǎn)仔，記錄產(chǎn)仔數(shù)及雌雄比例。所有雄鼠交配結(jié)束后進(jìn)行以下測(cè)定。

1.3.2 血漿睪酮濃度測(cè)定末次給藥24 h后，將全部小鼠斷頭取血，加入EDTA混合后離心分離血漿，用放射免疫法測(cè)定血漿睪酮濃度。

1.3.3 睪丸重量的測(cè)量取各組小鼠雙側(cè)睪丸，用冷生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙濾干，電子天平稱重。計(jì)算平均睪丸重量，并計(jì)算睪丸指數(shù)〔7〕,同時(shí)觀察記錄睪丸形態(tài)的變化。

1.3.4 睪丸組織形態(tài)的觀察取各組小鼠左側(cè)睪丸組織，用Bouin固定液固定后石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察生精小管形態(tài)和精子發(fā)生狀態(tài),包括曲細(xì)精管形態(tài)及密度、各級(jí)生精細(xì)胞層次、睪丸間質(zhì)數(shù)量及其中血管的變化。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.0進(jìn)行單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 體內(nèi)給藥劑量確定以人類實(shí)際接觸的臨床劑量作為低劑量組給藥劑量，預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)以低劑量組劑量的30倍作為高劑量組劑量，即1 350 mg/kg作為高劑量組給藥劑量，結(jié)果高劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在灌胃給藥20 d內(nèi)死亡率達(dá)80%，而低劑量組無(wú)一死亡。降低高劑量組劑量至低劑量組的20倍，結(jié)果死亡率也超過(guò)10%，隨即降低高劑量組劑量至低劑量組的10倍，給藥1個(gè)月后死亡率低于10%，故高劑量組給藥劑量確定為450 mg/kg。

2.2 甘草對(duì)成年雄性個(gè)體生殖功能的影響

2.2.1 甘草對(duì)成年雄性個(gè)體性行為和配種能力的影響實(shí)驗(yàn)雄鼠灌胃給藥到期后與發(fā)情期雌鼠合籠交配,并觀察雄性小鼠的性行為。在對(duì)照組雄鼠幾乎所有個(gè)體均表現(xiàn)出較頻繁的追逐與爬跨母鼠；高劑量組每次灌胃給藥后都表現(xiàn)有不同程度的精神萎靡等癥狀，因此對(duì)母鼠普遍表現(xiàn)為性冷淡；而低劑量組多數(shù)在灌胃給藥后30 min～1 h也表現(xiàn)出追逐與爬跨母鼠。次日凌晨檢查與雄鼠合籠的母鼠陰道栓檢出率及所產(chǎn)仔雌雄比見(jiàn)表1。與高、低劑量的雄鼠配種的母鼠妊娠率(母鼠陰道栓檢出率)及每組總產(chǎn)仔數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

表1　成年雄性個(gè)體灌胃給藥后配種結(jié)果( n=20)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

2.2.2 甘草對(duì)雄鼠分泌睪酮功能的影響高劑量組雄性鼠的血漿睪酮濃度〔(2.025±1.97)ng/ml〕比低劑量組〔(3.865±0.39)ng/ml〕和對(duì)照組〔(4.012±0.25)ng/ml〕要低,但差異不顯著(P>0.05)。而從高劑量組每只小鼠的血漿睪酮濃度看，高劑量甘草制劑對(duì)雄性小鼠睪丸分泌睪酮功能的影響具有較大的個(gè)體差異，其中有的小鼠血漿睪酮濃度僅0.049 ng/ml，而有的小鼠血漿睪酮濃度與對(duì)照組小鼠睪酮水平相近。

2.2.3 甘草對(duì)雄鼠睪丸外觀形態(tài)及重量的影響各組雄鼠睪丸外觀形態(tài)及質(zhì)地?zé)o明顯異常。表2顯示，雄鼠的睪丸重量及睪丸指數(shù)在對(duì)照組、低劑量組、高劑量組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2　各組雄性個(gè)體灌胃給藥后睪丸指數(shù)比較 ± s, n=20)

2.2.4 甘草對(duì)雄鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響實(shí)驗(yàn)后對(duì)小鼠左側(cè)睪丸進(jìn)行組織切片，HE染色后觀察，結(jié)果顯示：對(duì)照組雄鼠睪丸在光鏡下,曲細(xì)精管的生精細(xì)胞層數(shù)多，各級(jí)生精上皮細(xì)胞層次明顯，排列緊密，管腔內(nèi)充滿精子，精小管外基膜薄，間質(zhì)細(xì)胞成群分布。低劑量組與對(duì)照組的睪丸組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差別。但在高劑量組，約一半雄鼠的睪丸組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出曲細(xì)精管明顯退化、萎縮，睪丸曲細(xì)精管間隙明顯增大，精曲小管之間的結(jié)締組織增多，但結(jié)締組織中間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量卻明顯減少；但各級(jí)生精細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化，且分層明顯，見(jiàn)圖1。

2.3 母鼠妊娠期內(nèi)服甘草對(duì)F1代雄性個(gè)體生殖能力的影響

圖1　各組小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)(HE)

2.3.1 甘草對(duì)F1代雄鼠配種能力的影響各組妊娠母鼠所產(chǎn)F1代雄鼠與雌鼠的配種能力、配種后母鼠妊娠率(母鼠陰道栓檢出率)、平均窩產(chǎn)仔數(shù)及所產(chǎn)仔雌雄比均無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3　各組F1代雄鼠的交配結(jié)果( n=20)

2.3.2 給藥妊娠母鼠F1代雄性小鼠血漿睪酮濃度的測(cè)定各組F1代雄鼠的血漿睪酮濃度在高〔(3.798±0.18)ng/ml〕、低劑量組〔(3.965±0.15)ng/ml〕和對(duì)照組〔(3.942±0.28)ng/ml〕間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3.3 妊娠期內(nèi)服甘草對(duì)F1代雄鼠睪丸外觀形態(tài)及重量的影響各組雄鼠睪丸外觀形態(tài)及質(zhì)地均無(wú)明顯異常(P>0.05)。對(duì)孕期母鼠給藥后所產(chǎn)雄鼠成年后的睪丸重量及睪丸指數(shù)無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表4。

2.3.4 妊娠期內(nèi)服甘草對(duì)F1代雄鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響對(duì)孕期母鼠給藥后所產(chǎn)小鼠成年后的睪丸組織切片與一般正常小鼠睪丸組織切片相似無(wú)異常。見(jiàn)圖2。

表4　各組F1代雄性個(gè)體睪丸指數(shù)比較

圖2　各組F1代睪丸組織結(jié)構(gòu)觀察(HE，×200)

3討論

植物雌激素是一類具有類似動(dòng)物雌激素生物活性的植物成分，主要有異黃酮類和香豆素類，廣泛分布于自然界植物中，屬于環(huán)境雌激素之一，其生理活性多種多樣，是天然藥物的重要成分。植物雌激素的生物活性因其種類、劑量、營(yíng)養(yǎng)途徑及作用對(duì)象的不同而有較大的變化。其作用類似于雌二醇，但并不完全一樣，其生物效應(yīng)約相當(dāng)于雌二醇的10-3～10-5，具有較弱的雌激素和抗雌激素活性的雙重作用，即在內(nèi)源性雌激素水平較低時(shí)，它可與雌激素受體相結(jié)合，表現(xiàn)出雌激素激動(dòng)劑的作用，而在內(nèi)源性雌激素水平較高時(shí)，它則競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合雌激素受體，表現(xiàn)出抗雌激素作用〔8〕。有關(guān)植物雌激素對(duì)雄性動(dòng)物生殖功能的影響，有研究報(bào)道認(rèn)為，給雄性動(dòng)物喂飼含異黃酮類雌激素的植物可促進(jìn)睪丸增重和血清睪酮含量，并促進(jìn)睪丸曲細(xì)精管明顯增大，初級(jí)精母細(xì)胞形成提前，即具有促進(jìn)雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)發(fā)育的作用〔7〕，因而表現(xiàn)出與環(huán)境雌激素對(duì)雄性個(gè)體完全不一樣的作用〔9〕。但中草藥雌激素樣作用對(duì)睪丸毒性的研究報(bào)道并不多。

甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、緩急、止痛等功效。常用于脾胃虛弱、倦怠乏力、心悸短、咳嗽痰多、脘脹、四肢攣急、疼痛、癰腫瘡、緩解藥物毒性等。中醫(yī)界自古有 “十方九草”之說(shuō)〔10 〕。本研究結(jié)果提示臨床劑量的甘草對(duì)雄性個(gè)體生殖功能無(wú)明顯毒性作用，但長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)服臨床劑量10倍以上的甘草劑量會(huì)引起雄性個(gè)體一定程度的生殖毒性。

關(guān)于植物雌激素對(duì)雄性生殖細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響，朱鋒榮等〔11〕的研究認(rèn)為，在體外給予低濃度植物雌激素(0.1 μmol/L染料木素)時(shí)可顯著促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮,但當(dāng)植物雌激素濃度大于5 μmol/L時(shí),卻顯著抑制Leydig細(xì)胞的睪酮分泌。而苦參可使精子瞬間失活的最低有效濃度為 0.85～3.15 g/L,形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)苦參堿對(duì)精子有致死作用,而蘆薈對(duì)雄性鼠性腺、精液有一定的影響,使雌性小鼠的妊娠率降低,畸胎率升高〔12〕。本實(shí)驗(yàn)之所以選用睪丸間質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)來(lái)檢測(cè)甘草對(duì)生殖細(xì)胞的體外毒性，是因?yàn)樵摷?xì)胞作為合成和分泌雄激素(睪酮)的主要場(chǎng)所，其生存狀態(tài)及分泌睪酮的功能活動(dòng)可在很大程度上影響、甚或體現(xiàn)睪丸的生殖活動(dòng)〔13〕。此外，本研究中對(duì)分離到的間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后HE染色鏡檢，形態(tài)變化與劉玉志等〔14〕報(bào)道的相同，因此在本實(shí)驗(yàn)中未對(duì)相同方法分離培養(yǎng)的間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。本研究結(jié)果顯示，超過(guò)10 μg/ml甘草提取物濃度對(duì)體外原代培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和睪酮分泌均具有顯著抑制作用，且隨藥物濃度增加和培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用越加明顯。

關(guān)于生殖毒性實(shí)驗(yàn)分組,考慮到甘草并不是一味強(qiáng)毒性中草藥，其毒性實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)較為漫長(zhǎng)，所以無(wú)論在給藥的成年雄性還是妊娠母鼠均沒(méi)有更詳細(xì)階段的實(shí)驗(yàn)分組，給藥濃度也因此沒(méi)有進(jìn)一步分為高、中、低實(shí)驗(yàn)組。

此外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還觀察到，高劑量甘草制劑無(wú)論喂服雄性鼠還是妊娠母鼠，約80%以上的個(gè)體會(huì)表現(xiàn)出明顯的免疫抑制反應(yīng)，如引起小鼠多處皮膚膿腫、潰爛，甚至全身性皮下出現(xiàn)小膿包，后致皮膚增厚。這在雄鼠，勢(shì)必會(huì)影響其生理活動(dòng)，如性行為及隨后的配種能力，但對(duì)妊娠母鼠產(chǎn)仔無(wú)明顯影響，也不明顯影響妊娠母鼠所產(chǎn)F1代雄鼠的各項(xiàng)生理指標(biāo)。關(guān)于雌激素對(duì)機(jī)體免疫能力的影響，研究認(rèn)為，環(huán)境雌激素可改變機(jī)體免疫功能和增加自身免疫性的作用，生理濃度的雌激素可提高機(jī)體免疫力 ,劑量較大時(shí)則增加自身免疫性疾病的易感性〔15〕。有實(shí)驗(yàn)顯示 ,小鼠經(jīng)雌激素處理后 ,體內(nèi) T細(xì)胞功能減退 ,而 B細(xì)胞功能亢進(jìn) ,淋巴器官中淋巴細(xì)胞減少 ,促進(jìn) B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病〔16〕。但有關(guān)甘草對(duì)機(jī)體免疫功能的影響仍需做進(jìn)一步研究。

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〔2013-12-08修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)