結(jié)直腸癌組織中PAQR3、PDCD4基因甲基化水平與結(jié)直腸癌的關(guān)系

結(jié)直腸癌組織中PAQR3、PDCD4基因甲基化水平與結(jié)直腸癌的關(guān)系

李日恒楊瑞紅1宋艷敏張濤李青2呂志剛3張愛民安宇亮

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定071000)

摘要〔〕目的研究結(jié)直腸癌組織抑癌基因PAQR3、PDCD4甲基化水平，以及二者與結(jié)直腸癌臨床資料之間的關(guān)系。方法收集2013～2014年結(jié)直腸癌及癌旁正常組織標(biāo)本各54例，用甲基化特異性PCR(MSP)法檢測(cè)結(jié)直腸標(biāo)本中PAQR3、PDCD4基因甲基化水平。結(jié)果(1)PAQR3癌組織和癌旁組織甲基化率分別為 33.3%(18/54)和5.6%(3/54)，差異顯著(P<0.05)；PDCD4癌組織和癌旁組織發(fā)生甲基化率為分別為53.7%(29/54)和7.4%(7/54)，差異顯著(P<0.001)。二者同時(shí)檢測(cè)的甲基化陽(yáng)性率為87%，PAQR3和PDCD4沒有相關(guān)性(R=0.155，P=0.408)。(2)結(jié)直腸癌組織中PAQR3基因甲基化與性別、腫瘤部位無(wú)關(guān)，年齡越大、分化程度越低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)越深者，PAQR3甲基化發(fā)生率越高。結(jié)直腸癌組織中PDCD4 基因甲基化與性別、年齡、腫瘤部位無(wú)關(guān)，分化程度越低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)越深者，PDCD4 甲基化發(fā)生率越高。結(jié)論結(jié)直腸癌中PAQR3、PDCD4發(fā)生了甲基化，PAQR3基因甲基化水平與年齡、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)，PDCD4 甲基化水平與分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕PAQR3;PDCD4;甲基化;結(jié)直腸癌

中圖分類號(hào)〔〕R735〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(132777248)；2015年度河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目(20150069)

1任丘市婦幼保健院2河北省容城中醫(yī)院

3河北省清苑縣醫(yī)院

第一作者：李日恒(1972-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事普外科疾病研究。

結(jié)直腸癌的發(fā)生機(jī)制是復(fù)雜的。表觀遺傳學(xué)改變是一種不發(fā)生基因序列變化的基因表達(dá)異常，包括組蛋白印記、基因甲基化?；蚣谆悄[瘤的早期事件且過程可逆，為甲基化相關(guān)的基因應(yīng)用與臨床的早期診斷和治療提供了理論依據(jù)〔1，2〕。 PAQR3屬于孕酮和脂聯(lián)素受體(PAQR)家族中的一員，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因的作用，參與細(xì)胞的各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、細(xì)胞分裂增殖、分化和生殖細(xì)胞的成熟等生物學(xué)過程，主要通過負(fù)性調(diào)節(jié)Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，達(dá)到調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、癌癥的發(fā)生發(fā)展等生理過程的目的〔3～7〕。在胃癌組織中，PAQR3負(fù)性調(diào)控ERK和AKT的磷酸化，證明PAQR3通過抑制ERK和AKT的信號(hào)通路負(fù)性調(diào)節(jié)EMT的過程〔8～11〕。

PDCD4是與細(xì)胞凋亡相關(guān)的抑癌基因，參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯及多種信號(hào)通路，發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。已經(jīng)證實(shí)PDCD4在多種腫瘤組織中表達(dá)降低，其表達(dá)水平與多種腫瘤患者的預(yù)后有關(guān)，高表達(dá)的PDCD4還能增加化療藥物的感性〔12～14〕。PAQR3和PDCD4作為結(jié)直腸癌中的抑癌基因，其沉默機(jī)制并不明確，目前也沒有聯(lián)合檢測(cè)二者甲基化的報(bào)道。本文擬探討PAQR3、PDCD4在結(jié)直腸癌中基因甲基化及二者的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源及存儲(chǔ)方法54對(duì)結(jié)直腸癌組織、正常組織取自河北大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科，收集標(biāo)本時(shí)間為2013～2014年。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者術(shù)前均未接受放療、化療或免疫治療，收集癌組織標(biāo)本時(shí)除外已發(fā)生壞死的腫瘤組織，癌旁正常組織取距癌組織邊緣>10 cm的正常組織，組織取全層，診斷結(jié)果均由術(shù)后病理結(jié)果確定。男32例，女22例；直腸癌19例，結(jié)腸癌35例；年齡36～82歲，平均59.69歲。術(shù)中立即取標(biāo)本放置于液氮中，-80℃低溫保存，時(shí)間不超過6個(gè)月。

1.1.2主要試劑QIAGEN EpiTect Fast DNA Bisulfite試劑盒、蛋白酶K、RNaseA、EP管、槍頭、8聯(lián)排均由石家莊市惠友生物科技有限公司提供，β-actin引物、PAQR3甲基化和非甲基化引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。實(shí)驗(yàn)中DNA提取及核酸電泳過程中所需的STE裂解液、SDS、氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇、75%無(wú)水乙醇、Tris-飽和酚、酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)、氯仿/異戊醇(24∶1)、TE緩沖液、無(wú)水醋酸鈉等均由河北大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2甲基化特異性PCR(MSP)酚/氯仿抽提法提取組織DNA，根據(jù)EpiTect Fast DNA Bisulfit Kit 試劑盒說明書進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。PAQR3甲基化和非甲基化引物通過MethPrimer軟件設(shè)計(jì)，PAQR3甲基化引物(M)：5’-TTGTTGAAGAGCGCGTATTATATC-3(正義)，5’-TAAAAACCCGAAAATCTACTCGTA-3’(反義)，非甲基化引物(U)：5’-TTGTTGAAGAGTGTGTATTATATTGA-3’(正義)，5’-TAAAAAACCCAAAAATCTACTCATA-3’(反義)；PDCD4甲基化引物(M)：5’-TTTAGTTTCGGTTTCGTCGTTAC-3’(正義)，5’-GAAAAATCTCTAACCCTTCTCGC-3’(反義)；非甲基化引物(U)：5’-TTTAGTTTTGGTTTTGTTGTTATGA-3’(正義)，5’-CAAAAAATCTCTAACCCTTCTCACT-3’(R)。內(nèi)參基因β-actin引物：5'-GTG GAC ATC CGC AAA GAC-3'(正義)，5'-AAA GGG TGT AAC GCA ACT AA-3'(反義)，擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌組織中PAQR3、PDCD4基因甲基化水平結(jié)直腸癌組織中PAQR3甲基化率為33.3%(18/54)，明顯高于癌旁正常組織〔5.6%(3/54)〕(P<0.05)，見圖1。結(jié)直腸癌組織中PDCD4甲基化發(fā)生率為53.7%(29/54)，明顯高于癌旁正常組織〔7.4%(7/54)〕(P<0.001)，見圖2。二者聯(lián)合檢測(cè)的甲基化的陽(yáng)性率為87%。PAQR3和PDCD4沒有相關(guān)性(R=0.155，P=0.408)。

2.2PDCD4、PAQR3、基因甲基化與結(jié)直腸癌臨床資料之間的關(guān)系結(jié)直腸癌組織中PAQR3基因甲基化與性別、腫瘤部位無(wú)明顯相關(guān)性，年齡越大、分化程度越低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)越深者，PAQR3甲基化率越高；反之，越低。結(jié)直腸癌組織中PDCD4 基因甲基化水平與性別、年齡、腫瘤部位無(wú)關(guān)，分化程度越低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)越深者，PDCD4 發(fā)生率越高；反之，越低。見表1。

c：結(jié)直腸癌組織，n：癌旁正常組織，下圖同 圖1　結(jié)直腸癌組織中PAQR3 MSP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2　結(jié)直腸癌組織中PDCD4 MSP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

臨床資料nPAQR3甲基化P值PDCD4甲基化P值性別男3211(34.4)0.84517(53.1)0.918女227(31.8)12(54.5)年齡(歲)<60296(20.7)0.03416(55.2)0.816≥602512(48.0)13(52.0)部位結(jié)腸3510(28.6)0.31419(54.3)0.907直腸198(42.1)10(52.6)分化程度Ⅰ～Ⅱ級(jí)3015(50.0)0.00411(36.7)0.005Ⅲ級(jí)243(12.5)18(75.0)淋巴轉(zhuǎn)移無(wú)284(14.3)0.03610(35.7)0.006有2614(53.8)19(73.1)浸潤(rùn)深度黏膜肌層3114(45.2)0.03212(38.7)0.010漿膜周圍234(17.4)17(73.9)

3討論

PAQR3基因能在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。參與了細(xì)胞的各種信號(hào)通路，能影響細(xì)胞能量代謝、分裂增殖、分化以及生殖細(xì)胞成熟等生物學(xué)過程，又名 PKTG，可以編碼出37 kD大小的、N端朝胞質(zhì)、C端朝細(xì)胞器、位于高爾基體膜上的7次跨膜蛋白，能負(fù)性調(diào)控Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，此信號(hào)通路是經(jīng)典的絲裂原活化蛋白激酶級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑之一。此外，PAQR3通過另外兩種機(jī)制負(fù)性調(diào)控AKT信號(hào)通路，一方面，PAQR3敲除后，胞質(zhì)中與高爾基體結(jié)合的p110表達(dá)降低，PAQR3結(jié)合并改變胞質(zhì)中PI3K復(fù)合物的p110的亞細(xì)胞定位，阻止與p85調(diào)控位點(diǎn)的結(jié)合，導(dǎo)致PI3K失活以及AKT磷酸化，此過程也影響胰島素的信號(hào)通路；另一方面，PAQR3可以阻斷GPCR的Gβ位點(diǎn)，抑制AKT在GRCR激活的Gβ/γ位點(diǎn)的作用。Wang等〔15〕也證實(shí)PAQR3基因在結(jié)直腸癌組織中發(fā)揮抑癌的作用，PAQR3表達(dá)缺失縮短了PAQR3基因敲除后裸鼠的存活時(shí)間。在人類黑色素瘤A375的研究中，PAQR3過表達(dá)能明顯抑制細(xì)胞的擴(kuò)增及惡性轉(zhuǎn)化，裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，通過si-RNA技術(shù)使PAQR3重新表達(dá)能明顯抑制皮下成瘤的作用，其下游被異常激活的ERK活性明顯受到抑制〔16〕。

PDCD4是一種抑癌基因，參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯及多種信號(hào)通路，共同發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。PDCD4除了在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮抑制轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等作用，還能影響細(xì)胞類型的激活。

基因甲基化是腫瘤發(fā)生的早期事件，可以作為結(jié)直腸癌的診斷依據(jù)。目前還沒有關(guān)于PAQR3基因甲基化的報(bào)道。本研究證實(shí)了PAQR3基因甲基化參與結(jié)直腸癌的形成，可以作為結(jié)直腸癌的腫瘤標(biāo)記物。之前的相關(guān)研究證實(shí)了PDCD4表達(dá)沉默與多種腫瘤形成有關(guān)，而PDCD4表達(dá)沉默的機(jī)制很復(fù)雜，基因甲基化就是其中的一種，例如Gao等〔14〕同時(shí)檢測(cè)了8種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中PDCD4基因的甲基化水平，其中5個(gè)發(fā)生了完全甲基化，2個(gè)發(fā)生了部分甲基化，1個(gè)未發(fā)生甲基化，由于甲基化的過程是可逆的，用去甲基化藥物5-氮雜-2-脫氧胞苷處理后，PDCD4重新表達(dá)，細(xì)胞分化及轉(zhuǎn)移能力減弱。在不同組織中，PDCD4基因甲基化水平不同，本研究中證實(shí)了PDCD4基因在結(jié)直腸癌中發(fā)生了甲基化，而不是完全甲基化，說明甲基化在沉默基因的過程中只發(fā)揮了部分的作用，與癌旁正常組織有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明PDCD4基因甲基化在結(jié)直腸癌的形成中發(fā)揮了作用。單獨(dú)基因甲基化檢測(cè)無(wú)法確定其在結(jié)直腸癌中的作用，多種基因甲基化對(duì)于結(jié)直腸癌診斷提供更為準(zhǔn)確的依據(jù)。之前關(guān)于聯(lián)合基因檢測(cè)基因甲基化的報(bào)道有很多，能提高甲基化檢出率。James等〔17〕同時(shí)檢測(cè)了結(jié)直腸癌中DKK1和SFRP1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，并說明DKK1和SFRP1甲基化與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)，SFRP1在結(jié)直腸癌中最易發(fā)生甲基化。盡管我們分析二者在甲基化方面沒有相關(guān)性，但二者聯(lián)檢提高了甲基化的陽(yáng)性率，為結(jié)直腸癌診斷提供了依據(jù)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)PAQR3甲基化水平與年齡有關(guān)，年齡越大PAQR3基因甲基化率越高；而PDCD4基因甲基化水平與年齡無(wú)關(guān)，分析基因甲基化與年齡相關(guān)性，隨著年齡的增大，機(jī)體甲基化水平越高但年齡相關(guān)的甲基化水平改變的機(jī)制仍不是很明確，這種關(guān)系在不同的研究中說法不一，首先考慮年齡增大后，體內(nèi)酶活性發(fā)生了改變，促進(jìn)基因發(fā)生甲基化；此外，可能受地理環(huán)境因素及隨機(jī)抽樣、樣本量大小的影響，考慮這種差異無(wú)顯著意義〔18〕。基因甲基化是腫瘤發(fā)生的早期事件〔19〕，分化程度越低，基因甲基化水平越高，基因表達(dá)水平越低，發(fā)揮抑癌作用的能力越差。隨著分化程度的升高，甲基化發(fā)生的概率越低。因此，在分化程度越高的腫瘤組織中，基因甲基化的概率越高。二者甲基化與結(jié)直腸癌浸潤(rùn)深度和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，考慮為二者基因沉默所致；同時(shí)，二者可以作為結(jié)直腸癌的監(jiān)測(cè)預(yù)后指標(biāo)。

本研究證實(shí)了PAQR3和PDCD4基因甲基化在結(jié)直腸癌中的作用，為進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)、逆轉(zhuǎn)基因甲基化、重新表達(dá)抑癌基因提供了切實(shí)有效的理論依據(jù)。

4參考文獻(xiàn)

1Javier CF，Azuara D，Berenguer LA，etal.DNA methylation biomarkers for noninvasive diagnosis of colorectal cancer〔J〕.Cancer Prev Res，2013;6(7):656-65.

2Henri ST，Daniel MC，Michael BD，etal.Nutritional factors and gender influence age-related DNA methylation in the human rectal mucosa〔J〕.Aging Cell，2013;12(1):148-55.

3陳雁，謝小多.RKTG 基因功能研究〔J〕.細(xì)胞生物學(xué)雜志，2009;31(1):9-14.

4Tang YT，Hu TH，Arterburn M，etal.PAQR proteins:a novel membrane receptor family defined by an ancient 7-transmembrane pass motif〔J〕.J Mol Evol，2005;61:372-80.

5Feng L，Xie XD，Ding QR，etal.Spatial regulation of Raf kinase signaling by RKTG〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2007;104(36):14348-53.

6Cano E，Mahadevanl C.Parallel signal processing among mammalian MAPKs〔J〕.Trends Biochem Sci，1995;20(3):117-22.

7Fan FJ，F(xiàn)eng L，He J，etal.RKTG sequesters B-Raf to the Golgi apparatus and inhibits the proliferation and tumorigenicity of human malignant melanoma cells〔J〕.Carcinogenesis，2008;29(6):1157-63.

8Xie XD，Zhang YX，Jiang YH，etal.Suppressive function of RKTG on chemical arcinogen-induced skin carcinogenesis in mouse〔J〕.Carcinogenesis，2008;29(8):1632-8.

9Zhang Y，Jiang X，Qin X，etal.RKTG inhibits angiogenesis by suppressing MAPK-mediated autocrine VEGF signaling and is downregulated in clear-cell renal cell carcinoma〔J〕.Oncogene，2010;(29):5404-15.

10Ling ZQ，Guo W，Lu XX，etal.A Golgi specific protein PAQR3 is closely associated with the progression，metastasis and prognosis of human gastric cancers〔J〕.Ann Oncol，2014;25(7):1363-72.

11Jiang Y，Xie X，Zhang Y，etal.Regμlation of G-protein signaling by RKTG via sequestration of the G beta gamma subunit to the Golgi apparatus〔J〕.Mol Cell Biol，2010;(30):78-90.

12Wen YH，Shi X，Chiriboga L，etal.Alterations in the expression of PDCD4 in ductal carcinoma of the breast〔J〕.Oncol Rep，2007;18:1387-93.

13Kalinichenko SV，Kopantzev EP，Korobko EV，etal.PDCD4 protein and mRNA level alterations do not correlate in human lung tumors〔J〕.Lung Cancer，2008;62:173-80.

14Gao F，Wang XY，Zhu FL，etal.PDCD4 gene silencing in gliomas is associated with 5′CpG island methylation and unfavourable prognosis〔J〕.J Cell Mol Med，2009;13(10):4257-67.

15Wang X，LI XB，F(xiàn)an FJ，etal.PAQR3 plays a suppressive role in the tumorigenesis of colorectal cancers〔J〕.Carcinogenesis，2012;33(11):2228-35.

16Ding QQ，Huo LF，Yang JY，etal.Down-regulation of mycloid cell leukemia-1 through inhibiting Erk/Pin 1 pathway by sorafenib facilitates chemosensitization in breast cancer〔J〕.Cancer Res，2008;68(15):6109-17．

17James BR，Michael M，Miralem M，etal.Promoter methylation of Wnt antagonists DKK1 and SFRP1 is associated with opposing tumor subtypes in two large popμlations of colorectal cancer patients〔J〕.Carcinogenesis，2011;32(5):741-7.

18Lillycrop KA，Hoile SP，Grenfell L，etal.DNA methylation，ageing and the influence of early life nutrition〔J〕.Proc Nutr Soci，2014;73(3):413-21.

19Bird A.Perceptions of epigenetics〔J〕.Nature，2007;447(7143):396-8.

〔2015-01-19修回〕

(編輯徐杰)