SK-7041對血管緊張素Ⅱ致大鼠心肌細(xì)胞肥大的干預(yù)作用

SK-7041對血管緊張素Ⅱ致大鼠心肌細(xì)胞肥大的干預(yù)作用

陸瑩肖剛1任鵬蔣桂華王新春

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科，黑龍江哈爾濱150086)

摘要〔〕目的探討SK-7041在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)致心肌細(xì)胞肥大過程中的抑制作用。方法常規(guī)方法培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞，分為3組：對照組、肥大組、SK-7041組。利用AngⅡ刺激心肌細(xì)胞造成肥大模型，并給予SK-7041進(jìn)行干預(yù)。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)觀察β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)mRNA表達(dá)；相差顯微鏡和電鏡觀察心肌細(xì)胞的表面積和超微結(jié)構(gòu)變化；免疫組織化學(xué)法檢測c-fos蛋白的表達(dá)。結(jié)果大鼠原代心肌細(xì)胞在AngⅡ作用下表面積增加，超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；β-MHC mRNA和c-fos蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。給予SK-7041干預(yù)后，上述變化顯著緩解(P<0.05)。結(jié)論SK-7041可抑制AngⅡ刺激引起的心肌細(xì)胞肥大，為臨床上治療心肌肥厚提供一條新的思路。

關(guān)鍵詞〔〕SK-7041；血管緊張素Ⅱ；心肌細(xì)胞；肥大

中圖分類號〔〕R542.2〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(12511303)

通訊作者：肖剛(1971-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事心肌病發(fā)病機(jī)制的研究。

1解放軍第二一一醫(yī)院醫(yī)務(wù)處

第一作者：陸瑩(1971-)，女，副主任醫(yī)師，博士，主要從事心肌病發(fā)病機(jī)制的研究。

臨床上多種心血管疾病都伴有心肌肥大，如冠心病、高血壓性心臟病、風(fēng)濕性心臟病等等，但是對于心肌肥大的原因尚未完全明確。近年來研究表明，在心肌細(xì)胞肥大的信號傳導(dǎo)通路中，組蛋白脫乙酰基酶(HDACs)發(fā)揮著重要作用〔1〕，其中Ⅰ類HDACs對于心肌肥大有一定的促進(jìn)作用〔2，3〕，因此對于其抑制劑的研究逐漸受到學(xué)者們的重視〔4〕。3-(4-取代苯基)-N-羥基-2-丙烯酰胺(SK-7041)作為新型Ⅰ類HDACs抑制劑，主要作用于Ⅰ類HDACs 中的HDAC1、HDAC2，目前僅被用于腫瘤性疾病的研究〔5〕，其在心血管疾病方面的作用尚未被研究。因此，本課題組以血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)刺激心肌細(xì)胞造成肥大，給予SK-7041進(jìn)行干預(yù)，以觀察SK-7041對于心肌細(xì)胞肥大的抑制作用。

1材料與方法

1.1材料出生后1～3 d清潔級Wistar乳鼠，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實驗動物中心提供，使用許可證號：SYXK(黑)20020017。SK-7041(In2Gen/SK，Sigma公司)。DAB 顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。DMEM(美國Hyclone公司)。RT-PCR試劑盒(TakaRa公司)。RT-PCR引物由北京奧科公司合成。免疫組化SABC試劑盒(博士德公司)。兔抗大鼠c-fos多克隆抗體(Santa CruzBiotechnology Inc.USA)。

1.2心肌細(xì)胞培養(yǎng)和分組取出心臟后，剪成4～5塊，0.25% 胰酶反復(fù)消化、吸取上清，2 000 r/min離心10 min。加入含10% 胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，將細(xì)胞重懸并計數(shù)。按細(xì)胞數(shù)106/ml或107/ml將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中。心肌細(xì)胞分為對照組、肥大組和SK-7041組。96 h后換無血清培養(yǎng)液，同時SK-7041組加入SK-7041，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后肥大組和SK-7041組加入AngⅡ，使SK-7041終濃度為10-6mol/L，AngⅡ終濃度為2×10-7mol/L。37℃、5%CO2培養(yǎng)。加入AngⅡ后12 h和24 h進(jìn)行以下檢測。

1.3相差顯微鏡觀察心肌細(xì)胞面積變化加入AngⅡ后12 h和24 h于相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，各組均隨機(jī)選取10個視野，每個視野隨機(jī)選取10個心肌細(xì)胞，在1 600倍下應(yīng)用Motic Images1.3軟件測量心肌細(xì)胞面積，計算平均值。

1.4電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化胰酶消化細(xì)胞，用PBS液洗2次，2.5 %戊二醛固定，常規(guī)方法脫水、包埋、制作超薄切片、染色，在透射電鏡下觀察。

1.5反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)mRNA表達(dá)按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。β-MHC基因引物序列：上游：5'-ACC AAG CAG CCA CGC CAG TA-3'；下游：5'-TGC TTT GCC TTT GCC CTT GT-3'；擴(kuò)增片段長度為596 bp。β-actin基因引物序列：上游：5'-TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG-3'；下游：5'-GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG-3'；擴(kuò)增片段長度為764 bp。以β-actin為內(nèi)參照，結(jié)果以β-MHC/β-actin比值表示。各組樣本數(shù)為10例。

1.6免疫組化法檢測c-fos蛋白表達(dá)冷丙酮固定各組心肌細(xì)胞20 min，置于0.3% H2O2中30 min抑制內(nèi)源性過氧化物酶。加入一抗4℃過夜。加入二抗，室溫下2 h。DAB顯色。蘇木素復(fù)染。乙醇脫水，二甲苯脫乙醇，封片。鏡下觀察，c-fos以細(xì)胞質(zhì)黃染為陽性。采用鏡下隨機(jī)選取10個視野，分別計算c-fos表達(dá)陽性心肌細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

2結(jié)果

2.1SK-7041對心肌細(xì)胞表面積的影響在1 600倍鏡下，對照組、SK-7041組心肌細(xì)胞面積在12、24 h點均低于肥大組(P<0.05)；但SK-7041組心肌細(xì)胞面積仍高于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2電鏡結(jié)果對照組可見心肌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核偏于一側(cè)，呈梭形；細(xì)胞內(nèi)肌絲排列整齊，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核蛋白體豐富。肥大組可見心肌細(xì)胞體積較大，肌絲排列紊亂，線粒體內(nèi)膜髓鞘樣變；高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及扁平囊崩解。SK-7041組可見肥大的心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有大量的溶酶體，質(zhì)膜下粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張尤為明顯，細(xì)胞表面有質(zhì)膜葉片伸出，細(xì)胞核膜下有輕度染色質(zhì)的邊集。

2.3SK-7041對心肌細(xì)胞β-MHC mRNA表達(dá)的影響對照組、SK-7041組心肌細(xì)胞β-MHC mRNA表達(dá)在12、24 h點均低于肥大組(P<0.05)；但SK-7041組仍高于對照組(P<0.05)。見表2。

表1　各組心肌細(xì)胞面積比較

與對照組比較：1)P<0.05；與肥大組比較：2)P<0.05；下表同

表2　各組心肌細(xì)胞β-MHC mRNA表達(dá)比較

2.4SK-7041對心肌細(xì)胞c-fos蛋白表達(dá)的影響對照組、SK-7041組心肌細(xì)胞c-fos蛋白表達(dá)在12、24 h點均低于肥大組(P<0.05)；但SK-7041組仍高于對照組(P<0.05)，見表3。

表3　各組心肌細(xì)胞c-fos蛋白陽性表達(dá)比較

3討論

近年來，分子遺傳學(xué)、單細(xì)胞和器官生理學(xué)的進(jìn)展使得對涉及心肌肥大的各信號通路的研究日新月異，大量以基因工程技術(shù)處理過的動物模型使人們能夠在分子水平上探索各個不同的信號途徑及其交匯聯(lián)系，并發(fā)現(xiàn)了許多在心肌肥大和心功能衰竭過程中起重要作用的信號通路。心肌細(xì)胞肥大是臨床多種心血管疾病所伴有的一種病理性改變，探討其發(fā)生的病理生理機(jī)制，對于治療有重要意義。AngⅡ、去甲腎上腺素等多種化學(xué)刺激亦可造成心肌細(xì)胞肥大，同時伴有c-fos、c-jun、c-myc等原癌基因表達(dá)迅速加強(qiáng)，并促使蛋白質(zhì)合成增加，誘導(dǎo)心肌肥大。本文表明，在AngⅡ誘導(dǎo)的體外心肌細(xì)胞肥大模型中，心肌細(xì)胞表面積、c-fos蛋白和β-MHC基因的表達(dá)均增加，并出現(xiàn)了超微結(jié)構(gòu)的改變；給予SK-7041后減少了肥大心肌細(xì)胞的表面積，同時也降低了這一過程中的β-MHC mRNA和c-fos蛋白表達(dá)，從而證實了SK-7041對心肌細(xì)胞肥大的抑制作用。這一結(jié)果與其抑制特異性抑制Ⅰ類HDACs的作用相關(guān)。

目前認(rèn)為，心肌細(xì)胞核心組蛋白的乙酰化/去乙酰化與基因調(diào)控密切相關(guān)，催化組蛋白乙酰化的酶是組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(HATs)，而催化組蛋白去乙酰化的酶是HDACs，二者作用相反。HDACs可通過移去組蛋白H3、H4賴氨酸殘基上的乙酰基，使帶正電荷的賴氨酸殘基暴露，后者與DNA之間的相互作用可限制核小體在DNA之間的移動，進(jìn)而阻礙了作為基本轉(zhuǎn)錄單位的蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)入啟動子結(jié)合位點。由此可見，HDACs通過對組蛋白去乙酰化，可使DNA結(jié)構(gòu)更加緊密，從而抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄。HDACs分為三類，其中Ⅰ類HDACs中的HDAC1、2被認(rèn)為可促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，而Ⅱ類HDACs可抑制心肌細(xì)胞肥大〔6~8〕。

SK-7041作為一種新型的Ⅰ類HDACs抑制劑，與其他非特異性HDACs抑制劑(如TSA、丙戊酸)相比，可特異性抑制Ⅰ類HDACs 中的HDAC1/2復(fù)合物。目前主要被應(yīng)用于研究腫瘤性疾病〔9〕，尚未見于心肌細(xì)胞肥大的研究。本實驗結(jié)果證實了推測：SK-7041可有效抑制心肌細(xì)胞肥大，進(jìn)一步說明HDAC1/2對于心肌肥大的促進(jìn)作用，同時希望能夠為心肌肥大的發(fā)病機(jī)制研究提供一條新的思路。

參考文獻(xiàn)4

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〔2013-09-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)