高海拔地區(qū)大腸癌中nm23、ki67的表達及臨床意義

高海拔地區(qū)大腸癌中nm23、ki67的表達及臨床意義

才保加祁玉娟1

(青海大學附屬醫(yī)院胃腸外科，青海西寧810001)

摘要〔〕目的探討高海拔地區(qū)大腸癌nm23、ki67的表達及與臨床病理特征的關系。方法用免疫組織化學Elivision plus法，測定90例大腸癌(觀察組)及37例癌旁組織(對照組)中nm23、ki67的表達。結果兩組nm23、ki67的陽性表達率差異顯著；nm23、ki67的陽性表達與臨床分期及淋巴結轉移有關(P<0.05)。結論聯(lián)合檢測大腸癌中nm23、ki67的表達,有利于更好地評估大腸癌的生物學行為,綜合其他臨床檢查可對患者治療及預后判斷提供可靠依據。

關鍵詞〔〕大腸癌;免疫組化;nm23;ki67

中圖分類號〔〕R737.9〔文獻標識碼〕A〔

1青海省人民醫(yī)院腫瘤內科

第一作者：才保加(1971-)，男，副主任醫(yī)師， 主要從事胃腸外科研究。

大腸癌發(fā)病與患者的飲食結構、慢性炎癥、大腸腺瘤、吸煙等關系密切。本實驗探討高海拔地區(qū)大腸癌組織中nm23和ki67表達及其對診斷及預后的價值。

1資料與方法

1.1臨床資料2012年1月至2014年12月我院91例大腸癌患者為觀察組，均經病理確診，均為本地患者(居住海拔在2 200 m左右)。年齡35～72歲，中位年齡58歲；距離腫瘤邊緣3 cm以上5 cm之內取癌旁組織37例為對照組。

1.2檢測試劑及步驟nm23檢測均采用鼠源單克隆抗體Anti-Nm23-H1抗體,腫瘤抑制基因一抗，ki67檢測采用Elivision plus試劑盒，所有試劑盒均來源于福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。樣本經甲醛溶液固定、石蠟包埋后進行4 μm厚連續(xù)切片4張，脫蠟和水化后，用PBS(pH7.4)沖洗3次，每張切片加1滴一抗，室溫下孵育60 min，PBS再次沖洗后，加1滴聚合物增強劑，室溫下孵育30 min，PBS再次沖洗后，加1滴酶標抗，室溫下孵育30 min，PBS再次沖洗后，加1滴新鮮配制的DAB溶液，蘇朩素復染，PBS反藍；切片經梯度酒精脫水干燥，采用中性樹膠封固，整個操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.3結果判定采用典型的nm23、ki67大腸癌陽性標本作為陽性對照，用PBS液替代一抗檢測的標本作為陰性對照，所有檢測結果均由3位有經驗的病理醫(yī)師進行評估。nm23陽性結果反應為細胞質呈現棕黃色，陰性結果為淺藍色； ki-67 陽性反應為細胞核呈現棕褐色，陰性結果為藍色。按染色強度記分:棕褐色計3分，棕黃色計2分，淺黃色計1分，無色計0分，染色強度的評估充分與陰、陽性對照進行對比；每張切片至少觀察5個視野(400×)，計算染色強度分數及陽性細胞百分比平均值。染色強度分數×陽性細胞百分比≥2 則判斷為陽性(+)。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS15.0軟件進行χ2檢驗。

2結果

2.1nm23、ki67在各組織的表達與對照組比較nm23、ki67陽性表達〔27(72.9%)、8(21.6%)〕，觀察組nm23、ki67陽性表達有顯著差異〔42(46.2%)、56(61.5%)，(P<0.01)〕

2.2nm23、ki67在大腸癌組織免疫組化染色結果nm23 陽性表達主要定位于細胞質，呈棕黃色或棕褐色染色。ki67陽性反應為棕褐色、顆粒狀，定位于細胞核。nm23、ki67在大腸癌組織的表達見圖1。

圖1　觀察組nm23、ki67免疫組化結果(×400)

2.3nm23、ki67在不同臨床特征陽性表達比較nm23和Ki67的陽性表達在不同年齡、性別、腫瘤直徑、組織分化、大體類型、部位之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。有淋巴結轉移者的nm23陽性表達明顯低于無淋巴結轉移者(P<0.05)；有淋巴結轉者的ki67陽性表達明顯高于無淋巴結轉者(P<0.05)；Dukes C、D期患者的ki67陽性表達明顯高于Dukes A、B期(P<0.05)。見表1。

表1　nm23、ki67與大腸癌臨床病理特征的關系〔 n(%)〕

與Dukes C、D期比較：1)P<0.05；與無淋巴結轉移比較：2)P<0.05

3討論

腫瘤遺傳學是遺傳學和腫瘤學之間的邊緣學科，著重研究惡性腫瘤的發(fā)生與遺傳關系。主要包括三方面的研究內容：①惡性腫瘤易患性的遺傳背景。②遺傳物質的變化或遺傳信息表達的異常同惡性腫瘤發(fā)生的關系。③以遺傳學的方法分析環(huán)境中導致惡性腫瘤發(fā)生的因素。腫瘤遺傳學的研究不僅可以為腫瘤的發(fā)生提供理論基礎，也可以為惡性腫瘤的診斷和防治提供線索。目前有4種關于腫瘤發(fā)生的遺傳機制的假說：即染色體不平衡假說認為染色體異常是癌變的原初變化，各種因素造成細胞的不對稱分裂而使子細胞內遺傳物質分布不平衡，從而影響基因的正常功能，是腫瘤發(fā)生的原因。兩次突變假說認為基因第一次突變是腫瘤的始動過程，第二次突變是促進過程；兩次突變假說已被不少學者接受并不斷地予以修改和補充，可用于解釋各種遺傳型和非遺傳型腫瘤形成的機制。轉化基因假說認為正常細胞轉化為惡性細胞是由一種所謂轉化基因(Tr)所決定的，正常情況下轉化基因被調節(jié)基因i+Tr所阻遏，i+Tr基因經突變成為突變型基因i0Tr，在純合體i0Tr/i0Tr中Tr基因消除阻遏而被激活，于是細胞發(fā)生惡性轉化。癌基因假說認為在人和動物細胞中發(fā)現與病毒癌基因同源的DNA順序，稱為原癌基因，這些基因在正常細胞中轉錄活性較低或雖有轉錄但對細胞無害，原癌基因被活化成為癌基因后便大量轉錄，或者發(fā)生突變后便轉錄出異常產物，這兩種情況都會導致細胞癌變。

本研究結果可見nm23對于癌癥的發(fā)展應該是有一定的作用，自1988年nm23基因被發(fā)現其在低轉移細胞中表達是高轉移細胞的10倍，而被作為第一個抑制腫瘤轉移的基因，目前關于人nm23家庭已經發(fā)現至少10個亞型，而且nm23低表達與腫瘤轉移的相關性已經被多項研究證實〔1～4〕。但是關于nm23表達在不同腫瘤之間并沒有一致性結論，這可能與癌癥的類型、特異性抗體及免疫組化法中的計分方法沒有統(tǒng)一的標準有關，而且有研究發(fā)現nm23在原發(fā)性癌癥早期是增加的，但發(fā)生淋巴轉移后nm23的水平才降低，可見nm23的表達在癌癥發(fā)生和發(fā)展過程中呈現一種動態(tài)變化〔5〕。而且nm23的表達在原發(fā)性癌癥中變化由于nm23基因不穩(wěn)定造成的〔6〕。在細菌和低級真核細胞的研究中發(fā)現，nm23作為磷酸組氨酸能夠作用于組氨酸蛋白激酶和組氨酸激酶信號傳遞過程，保證細胞在受到外界刺激時的磷酸傳遞處于平衡狀態(tài)〔7，8〕。初始下降nm23-H1水平可以進一步促進癌癥轉移。nm23-H1表達3′5′核酸外切酶活性可能參與DNA修復，降低細胞轉移，如果nm23表達減少，可能會導致細胞逃避凋亡〔9，10〕。轉移是惡性腫瘤的一個關鍵的特性，Ki67作為一種細胞核抗原，在乳腺癌的研究中較為廣泛，通過動態(tài)的Ki67表達水平監(jiān)測，對于癌癥的預測、預防等都具有重要意義〔11～15〕，與nm23一樣，最常用評估Ki67的方法主要是免疫組織化學，由于多個實驗室的方法不一致，盡管明確ki67水平監(jiān)測的重要意義，但是常規(guī)使用的腫瘤生物標志物還沒有得到普遍共識，標準無法統(tǒng)一，結果可靠性較差〔16〕， ki67影響腫瘤的確切機制目前尚不明確，但大量的研究已經證實ki67的表達與腫瘤的轉移和發(fā)展具有明顯的相關性，由此認為ki67可能是通過染色質來加速細胞分裂，使腫瘤細胞的增殖失控，細胞生長速度加快，具有更高的侵襲性，轉移機會明顯增高，導致患者預后更差。

綜上，nm23和ki67與大腸癌的發(fā)生和發(fā)展都有明顯的相關性，但沒有統(tǒng)一的標準，因此不宜將該檢測指標作為評估腫瘤的唯一標準，而應該對各項檢查進行綜合分析。

4參考文獻

1Boissan M,Lacombe ML.Learning about the functions of NME/NM23:lessons from knockout mice to silencing strategies〔J〕.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,2011;384(4-5):421-31.

2Ferguson AW,Flatow U,MacDonald NJ,etal.Increased sensitivity to cisplatin by nm23-transfected tumor cell lines〔J〕.Cancer Res,1996;56(13):2931-5.

3Lizuka N,Miyamoto K,Tangoku A,etal.Downregulation of intracellular nm23-H1 prevents cisplatin-induced DNA damage in oesophageal cancer cells:possible association with Na(+),K(+)-ATPase〔J〕.Br J Cancer,2000;83(9):1209-15.

4Wang LS,Chow KC,Lien YC,etal.Prognostic significance of nm23-H1 expression in esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Eur J Cardiothorac Surg,2004;26(2):419-24.

5Wang YF,Chen JY,Chang SY,etal.Nm23-H1 expression of metastatic tumors in the lymph nodes is a prognostic indicator of oral squamous cell carcinoma〔J〕.Int J Cancer,2008;122(2):377-86.

6Jarrett SG,Novak M,Dabernat S,etal.Metastasis suppressor NM23-H1 promotes repair of UV-induced DNA damage and suppresses UV-induced melanomagenesis〔J〕.Cancer Res,2012;72(1):133-43.

7Besant PG,Attwood PV.Mammalian histidine kinases〔J〕.Biochim Biophys Acta,2005;1754(1-2):281-90.

8Steeg PS,Palmieri D,Ouatas T,etal.Histidine kinases and histidine phosphorylated proteins in mammalian cell biology,signal transduction and cancer〔J〕.Cancer Lett,2003;190(1):1-12.

9Conery AR,Sever S,Harlow E.Nucleoside diphosphate kinase Nm23-H1 regulates chromosomal stability by activating the GTPase dynamin during cytokinesis〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2010;107(35):15461-6.

10Kaetzel DM,Zhang Q,Yang M,etal.Potential roles of3′-5′ exonuclease activity of NM23-H1 in DNA repair and malignant progression〔J〕.J Bioenerg Biomembr,2006;38(3-4):163-7.

11Dowsett M,Nielsen TO,A'Hern R,etal.Assessment of Ki67 in breast cancer:recommendations from the International Ki67 in breast cancer working group〔J〕.J Natl Cancer Inst,2011;103(22):1656-64.

12Goldhirsch A,Wood WC,Coates AS,etal.Strategies for subtypes-dealing with the diversity of breast cancer:highlights of the St.Gallen International expert consensus on the primary therapy of early breast〔J〕.Cancer Ann Oncol,2011;22(8):1736-47.

13Yerushalmi R,Woods R,Ravdin PM,etal.Ki67 in breast cancer:prognostic and predictive potential〔J〕.Lancet Oncol,2010;11(2):174-83.

14Ellis MJ,Suman VJ,Hoog J,etal.Randomized phase Ⅱ neoadjuvant comparison between letrozole anastrozole,and exemestane for postmenopausal women with estrogen receptor-rich stage 2 to3 breast cancer:clinical and biomarker outcomes and predictive value of the baseline PAM50-based intrinsic subtype-ACOSOG Z1031〔J〕.J Clin Oncol,2011;29(17):2342-9.

15Freedman OC,Amir E,Hanna W,etal.A randomized trial exploring the biomarker effects of neoadjuvant sequential treatment with exemestane and anastrozole in post-menopausal women with hormone receptor-positive breast cancer〔J〕.Breast Cancer Res Treat,2010;119(1):155-61.

16Harris L,Fritsche H,Mennel R,etal.American society of clinical oncology 2007 update of recommendations for the use of tumor markers in breast cancer〔J〕.J Clin Oncol,2007;25(33):5287-312.

〔2014-03-19修回〕

(編輯苑云杰)