榧樹種子層積過程中主要貯藏物質含量及酶活性的變化

李金霞，戴文圣

（1. 浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300；2. 浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 臨安 311300）

榧樹種子層積過程中主要貯藏物質含量及酶活性的變化

李金霞1,2，戴文圣1,2

（1. 浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300；2. 浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 臨安 311300）

對2013年10月采自浙江省嵊州市榧樹（Torreya grandis）種子當年進行層積催芽，通過測定種子胚乳淀粉、可溶性糖、蛋白質和脂肪含量以及與貯藏物質相關酶類中的淀粉酶、蛋白酶和酸性磷酸酯酶的活性變化，研究其主要貯藏物質和相關酶類的變化規律。結果表明：榧樹種子層積150 d后，淀粉含量減少40.30%，蛋白質含量減少 57.78%，粗脂肪含量減少 22.45%；可溶性糖含量呈先降低后升高；淀粉酶、蛋白酶、酸性磷酸酶活性在層積處理0 ～ 120 d時逐漸升高，120 ～ 150d時略有降低。這說明榧樹種子在層積處理過程中，主要貯藏物質在相關酶類的催化下逐漸分解，為種胚的發育和種子萌發提供能量和物質基礎。

榧樹種子；層積；淀粉；可溶性蛋白；粗脂肪；酶活性

榧樹（Torreya grandis）系裸子植物紅豆杉科（Taxaceae）榧樹屬（Torreya）一種，分布在我國東部從北亞熱帶到中亞熱帶南緣的皖、浙、蘇、贛、鄂、閩、湘、黔等省的丘陵至中山地帶，其中以皖、浙分布最多[1～4]。榧樹種子目前在生產上主要通過播種育苗，用作培育香榧的嫁接砧木。但由于榧樹種子自然成熟后，尚需經過3個月以上貯藏，達到生理后熟后才能萌發[5]，這個過程對榧樹育苗具有至關重要的作用。因此，研究榧樹種子在層積催芽、解除休眠過程中胚乳主要貯藏物質含量的變化和相關酶類的活性，揭示榧樹種子的萌發機理，闡明主要貯藏物質含量變化與相關酶活性變化之間的關系，對實現合理調控種子種胚發育和種子萌發進程，提高種子萌發力和整齊度，具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料采集與處理

試驗所用榧樹種子采于浙江省嵊州市里南鄉屏岫村，海拔500 m，樹齡100 a以上。2013年10月初，在假種皮轉呈黃色、部分開裂時采收。采收后的種實，放置于陰涼通風處，自然堆漚5 d，搓去假種皮，清除雜物，洗凈種子。2013年10月12日，在室外以河沙為材料鋪設層積床，搭建低、高兩層塑料棚對種子進行層積催芽。之后，經常檢查、適時噴水，保持種沙濕潤、透氣，避免過干、過濕。

1.2 測定內容與方法

分別在層積處理后的0、30、60、90、120、130、140、150 d采樣，對榧樹種子胚乳各生理生化指標進行測定，重復三次。主要測定指標有：可溶性總糖和淀粉含量，蛋白質含量，粗脂肪含量；淀粉酶活性，蛋白酶活性和酸性磷酸酶活性。

具體的測定方法如下：可溶性總糖和淀粉含量的測定采用蒽酮比色法[7]；蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法[8]；粗脂肪含量的測定采用索氏提取法[9]；淀粉酶活性的測定采用3，5 - 二硝基水楊酸比色法[10]；蛋白酶活性的測定采用Folin-酚法[11]；酸性磷酸酶活性的測定采用對硝基酚磷酸鈉法[12]。

1.3 數據分析處理

采用Excel 2010對數據進行整理，用SPSS17.0軟件對數據進行方差分析，利用LSD法進行多重比較，用Sigma Plot 12.5軟件進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 榧樹種子淀粉和可溶性糖的含量及淀粉酶活性變化

由圖1可知，隨著層積時間的延長，榧樹種子淀粉含量逐漸減少。層積前榧樹種子淀粉含量為112.79 mg/g，層積150 d時，其淀粉含量為67.33 mg/g，比層積前減少了40.30%。

從圖1還可看出，隨著層積時間延長，榧樹種子可溶性糖含量，呈先降低后升高的趨勢。層積前榧樹種子可溶性糖含量為19.54 mg/g，層積90 d，可溶性糖含量降至最低值，為7.80 mg/g，層積150 d時，可溶性糖含量上升至22.73 mg/g。

圖1 層積過程中榧樹種子淀粉和可溶性糖含量動態變化Figure 1 Dynamics of starch and soluble sugar content of T.grandis seed during stratification

圖2 層積過程中榧樹種子淀粉酶活性動態變化Figure 2 Dynamics of amylase activity of T.g randis seed during stratification

由圖 2可看出，隨著層積時間延長，榧樹種子淀粉酶活性基本呈現先升高后降低的趨勢。總淀粉酶活性在層積前為1.81 mg·g-1·min-1，層積120 d時，其活性達到最大值，為2.28 mg·g-1·min-1，層積150 d時，為 2.05 mg·g-1·min-1；在整個層積過程中，α-淀粉酶活性均大于β-淀粉酶，其中，α-淀粉酶在層積前為1.07 mg·g-1·min-1，層積90 d時，達到最大值1.22 mg·g-1·min-1，層積120 ～ 130 d，α-淀粉酶變化不大，此后，α-淀粉酶活性逐漸下降，層積150 d時，其活性降至1.06 mg·g-1·min-1；β-淀粉酶在層積前為0.73 mg·g-1·min-1，層積120d時，達到最大值1.16 mg·g-1·min-1，層積130 ～ 140 d，β-淀粉酶活性變化不大，150 d時下降至0.92 mg·g-1·min-1。

在層積過程中，榧樹種子淀粉含量逐漸降低，淀粉大量分解，為胚的發育和種子萌發提供營養。可溶性糖含量呈現先降低后升高的趨勢，可能與其作為呼吸代謝的底物可直接被利用及種子胚乳內營養物質的相互轉化有關。淀粉酶活性呈現先升高后降低的趨勢，這說明在層積處理前期，胚乳中的淀粉逐漸被淀粉酶分解為小分子的碳水化合物，供種胚利用完成生理后熟；在層積處理后期，種子淀粉酶活性略降低，這可能與淀粉作為底物的含量減少以及可溶性糖含量的增加有關。在層積處理過程中，α-淀粉酶活性總體上高于 β-淀粉酶，即在種胚完成生理后熟和種子萌發的過程中，降解淀粉的酶主要是α-淀粉酶，這在一定程度上說明，在榧樹種子中存在的淀粉主要是直鏈淀粉，或者直鏈淀粉的降解較快，為種子發育提供主要的糖類營養物質。

2.2 榧樹種子蛋白質含量和蛋白酶活性變化

由圖3可知，隨著層積時間的延長，榧樹種子可溶性蛋白質含量逐漸減少。層積前榧樹種子可溶性蛋白質含量為17.22 mg/g，層積150 d時，其含量為7.27 mg/g，比層積前減少了57.78%。

從圖3還可知，隨著層積時間的延長，榧樹種子蛋白酶活性呈先升高后逐漸降低的趨勢。層積前榧樹種子蛋白酶活性為1.41 μmol·g-1·h-1，層積120 d時，達到最大值，為7.39 μmol·g-1·h-1，層積150 d時，蛋白酶活性為4.11 μmol·g-1·h-1。

分析表明，在層積過程中，榧樹種子胚乳可溶性蛋白質含量逐漸降低，在層積0～120d時，可溶性蛋白質含量降低幅度較大，在層積120～150 d時，可溶性蛋白質降低幅度減緩；與此同時，蛋白酶的活性呈現先升高后逐漸降低的趨勢，這與蛋白質的變化相一致。這說明，在層積處理前期，種胚發育需要胚乳提供大量的營養物質，蛋白質在蛋白酶的作用下開始降解，在層積處理后期，胚根已經突破種皮，蛋白質含量顯著減低，從胚乳內部獲取營養物質的需求減弱，蛋白酶活性降低。

2.3 榧樹種子粗脂肪含量和酸性磷酸酯酶活性變化

由圖4可知，隨著層積時間的延長，榧樹種子粗脂肪含量逐漸減少。層積前榧樹種子粗脂肪含量為50.55%，層積150 d時，粗脂肪含量為39.20%，比層積前減少了22.45%。

由圖4還可以看出，隨著層積時間的延長，榧樹種子酸性磷酸酯酶活性呈先升高后降低的趨勢。層積前榧樹種子酸性磷酸酯酶活性為63.68 nmol·mg-1·min-1，層積120 d時達到最大值，為130.92 nmol·mg-1·min-1，層積150 d時，酸性磷酸酶酯活性為94.91 nmol·mg-1·min-1。

圖3 層積過程中榧樹種子蛋白質含量和蛋白酶活性動態變化Figure 3 Dynamics of protein content and its activity ofT. grandis seed during stratification

圖4 層積過程中榧樹種子粗脂肪含量和酸性磷酸酯酶活性動態變化Figure 4 Dynamics of crude fat content and acid phosphataseactivityof T. grandisseed during stratification

分析表明，在層積過程中，榧樹種子粗脂肪含量逐漸降低，脂肪分解轉化為種胚可直接利用的營養物質，為層積后期種子的萌發奠定物質基礎；酸性磷酸酯酶活性在層積處理處理前期逐漸升高，在層積處理后期其活性逐漸降低，這與粗脂肪含量的降解相一致。

3 結論與討論

在榧樹種子層積過程中，通過對種子胚乳淀粉、可溶性糖、蛋白質和脂肪以及與貯藏物質相關酶類中的淀粉酶、蛋白酶和酸性磷酸酯酶的測定分析得出：①榧樹種子在層積過程中，胚乳中的淀粉、粗脂肪含量逐漸降低，貯藏物質進行降解，轉化為可溶性的各種物質，可為胚的發育成熟和種子萌發提供能量，這與南方紅豆杉種子層積處理的結果相一致[14～15]；②榧樹種子蛋白質含量在層積過程中逐漸降低，這與王家源等[16]對青錢柳種子以及戴萍[17]對光皮樹種子的研究結果相一致；③榧樹種子可溶性糖含量在層積過程中呈現先降低后升高的趨勢，與黃儒珠等[18]、李秋琦等[19]對南方紅豆杉，廖云嬌等[20]對東北紅豆杉的研究結果不同，可能與前人采用變溫層積和化學試劑浸種有一定關系；④榧樹種子淀粉酶和蛋白酶在層積過程中呈現先升高后降低的趨勢，這與李生平[21]對銀杏種子的研究結果相一致；⑤榧樹種子層積處理120 d時，酸性磷酸酶活性達到最大，而張艷杰[14]對南方紅豆杉種子的研究中，酸性磷酸酯酶的變化無明顯的規律性。

層積處理是解除種子休眠常用的方法，在理論研究和實際生產中應用較為廣泛[13]。本研究中發現，榧樹種子在萌發過程中的代謝復雜，要真正揭示種子胚乳中貯藏物質的分解、各代謝途徑的調控以及能量代謝與種子完成生理后熟、進一步萌發之間的相互關系，尚需進一步深入研究。在榧樹種子層積催芽過程中，各內源激素的含量變化以及激素之間的相互作用等問題也有待進一步研究。

建議今后在開展類似研究中，需要注意以下幾個問題：（1）進行層積的榧樹種子，盡可能保證種子成熟度一致，要充分成熟采收，且處理及時，層積方法得當，保持試驗材料的一致性；（2）在對榧樹種子的貯藏物質、酶類和內源激素等相關生理生化指標進行測定分析時，最好選擇榧樹生長結實正常的年份采樣作試材，或進行2 ～ 3 a的連續觀測其穩定性，盡可能減少立地條件、天氣狀況（如長時間的高溫、干旱或者雨量過大等）和管理措施等環境條件對種子生長和成熟的影響，降低種子自身“大小年”對試驗結果的影響。

[1]程曉建，黎章矩，喻衛武，等. 榧樹的資源分布與生態習性[J]. 浙江林學院學報，2007，24（4）：383-388.

[2]黎章矩，程曉建，戴文圣，等. 浙江香榧生產歷史、現狀與發展[J]. 浙江林學院學報，2005，21（4）：471-474.

[3]戴文圣，黎章矩，曹福亮，等. 我國榧樹研究文獻分析[J]. 浙江林業科技，2006，26（4）：51-57.

[4]孟鴻飛，金國龍，翁仲源. 諸暨市香榧古樹資源調查[J]. 浙江林學院學報，2003，20（2）：134-136.

[5]黎章矩，戴文圣. 中國香榧[M]. 北京：科學出版社，2007.

[6]戴文圣，黎章矩，程曉建，等. 榧樹種子催芽方法[P]. 中國：200610052655.9，2007-01-24.

[7]崔喜燕. 基礎生物化學實驗方法和技術[M]. 北京：中國林業出版社，2008.

[8]陳建勛，王曉峰. 植物生理學實驗指導[M]. 廣州：華南理工大學出版社，2002.

[9]郝再彬，蒼晶，徐仲. 植物生理實驗[M]. 哈爾濱：哈爾濱工業大學出版社，2004.

[10]王晶英，敖紅，張杰，等. 植物生理生化試驗技術及原理[M]. 哈爾濱：東北林業大學出版社，2003.

[11]黃學林，陳潤政，張北壯. 種子生理實驗手冊[M]. 北京：農業出版社，1990.

[12]宋松泉，程紅焱，龍春林，等. 種子生物學研究指南[M]. 北京：科學出版社，2005.

[13]劉雅帥. 山茱萸種子休眠機理研究[D]. 南京：南京林業大學，2008.

[14]張艷杰. 南方紅豆杉種子休眠機理的研究[D]. 南京：南京林業大學，2007.

[15]于海蓮，郭惠紅，李鳳蘭. 南方紅豆杉種子休眠機理及催芽技術的研究[D]. 北京：北京林業大學，2009.

[16]王家源，方升佐. 青錢柳種子層積過程中貯藏物質含量及酶活性的變化[J]. 南京林業大學學報（自然科學版），2007，31（1）：111-113.

[17]戴萍. 光皮樹種子萌發的生理特性及破眠技術研究[D]. 南京：南京林業大學，2011.

[18]黃儒珠，郭祥泉，方興添，等. 變溫層積處理對南方紅豆杉種子生理生化特性的影響[J]. 福建師范大學學報（自然科學版），2006，22 （2）：95-98.

[19]李秋琦，于海蓮，周鳳嫻，等. 南方紅豆杉種子休眠解除過程中的生理生化特性[J]. 貴州農業科學，2012，40（6）：26-30.

[20]廖云嬌，李雪，董學會. 不同變溫層積過程中東北紅豆杉種子生理生化特性和胚形態的變化[J]. 中國農業大學學報，2010，15（1）: 39-44. [21]李生平. 銀杏種子萌發過程中貯藏物質代謝機理的研究[D]. 南京：南京林業大學，2004.

Storage Substance Content and Their Enzyme Activity During Stratification of Torreya grandis Seed

LI Jin-xia1,2，DAI Wen-sheng1,2
（1. The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 2. School of Forestry and Bio-technology, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China）

Seeds of Torreya grandis were collected in the Oct., 2013 in Shengzhou, Zhejiang province, and were stratified on the same month. Determinations were made on content of starch, soluble sugar, protein, fat, activities of amylase, protease, acid phosphatase. The results demonstrated that 150 days later, the content of starch, protein and crude fat of treated seeds decreased by 40.30%, 57.78% and 22.45% respectively, while the content of soluble sugar decreased first and then increased. The activity of amylase, protease and acid phosphatase increased from 0 to 120th days, and slightly decreased from 120th to 150th days of the stratification. The experiment indicated that the storage substances decomposed under the catalysis of relative enzymes for providing energy of embryo development and seed germination.

seeds of Torreya grandis; stratification; starch; protein; crude fat; enzyme activity

S722.1+4

A

1001-3776（2015）05-0037-04

2015-02-03；

2015-05-16

浙江省重點科技專項（2012C12904-12）

李金霞（1988-），女，河南焦作人，碩士，從事經濟林培育與利用研究；*通訊作者。