山核桃內生真菌對山核桃干腐病抑制作用初步研究

朱誠棋，周 樂，蘇 秀

山核桃內生真菌對山核桃干腐病抑制作用初步研究

朱誠棋，周 樂，蘇 秀*

（浙江農林大學林業與生物技術學院，浙江 臨安，311300）

采用PDA培養基分離了不同感病等級山核桃（Carya cathayensis）樹組織中的內生真菌，共得到28種內生真菌，用兩點對峙法測定這28種內生真菌對山核桃干腐病（Canker disease of Carya cathayensis）的生長抑制作用。結果表明：有3株內生真菌（編號分別為X-5、X-7和H-3）對山核桃干腐病有明顯抑制作用；在對峙培養的72 h內，X-5對山核桃干腐病的抑制作用分別為45.32%、34.98%、28.61%，X-7抑制作用分別為10.73%、23.03%、12.01%，H-3抑制作用分別為49.72%、44.30%、32.03%；其余內生真菌對山核桃干腐病均無抑制作用或在對峙培養的后期出現比較弱的抑制作用。

山核桃干腐病；內生真菌；生物防治

山核桃（Carya cathayensis）為胡桃科（Juglandaceae）山核桃屬（Carya）落葉喬木，主要分布在浙、皖交界的天目山區、昌北區，為我國特有的著名干果和木本油料樹種，是集生態和經濟效益為一體的生態經濟樹種[1]。近年來，山核桃干腐病發生非常嚴重，在主產區臨安、淳安、桐廬、寧國，株發病率高達80%～100%，病株上少則幾個病斑，多則幾十個病斑，最嚴重的可達數百個病斑，造成枝枯或株枯，嚴重影響了山核桃林生長發育和山核桃品質[2]。目前，山核桃干腐病的防治主要采用化學農藥噴灑法和物理刮除病斑法[3～5]。直接刮除病斑會人為造成樹體新的傷口，易再度引發病菌侵入，且防治效果不持久，生產上不提倡使用；適當的化學防治對于控制山核桃干腐病非常必要[6～8]，但是從長遠考慮，山核桃是一種高檔干果，對食品安全性要求很高，應選擇生物防治的方法。利用植物內生菌及其代謝產物防治病蟲害是生物防治的一個重要方向，是目前研究的熱點之一[9]，但山核桃內生真菌資源及其生物防治作用尚未見研究報道。本文初步研究了山核桃內生真菌對山核桃干腐病的抑制作用，為山核桃干腐病的生物防治方法提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣地自然概況 山核桃組織樣品采自浙江省臨安市橫路鎮和安徽省寧國市仙霞鎮。

橫路樣地GPS定位：30° 20′ 02.3″ N，119° 18′ 16.5″ E，精度3 m，海拔256 m，坡度45°，坡向東南，周圍環境為純林，有少量松樹、竹子并有紅薯間作，樹齡為15～20 a。

仙霞樣地GPS定位：30° 24′ 48.7″ N，119° 16′ 29.9″ E，精度4 m，海拔175 m，坡度40°，坡向西，周圍環境為純林，周圍有毛竹、雷竹，樹齡為25～30 a。

1.1.2 試驗材料與儀器 山核桃干腐病病原菌茶藨子葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）由浙江農林大學森林保護學科實驗室提供[10]。山核桃樹干和枝條組織采自以上兩個樣地，采集時間是2012年4月12日上午。試驗試劑主要有5%的NaClO溶液、75%的乙醇溶液等。儀器主要有三洋超凈工作臺MCV-B131F（T）、三洋全自動高壓蒸汽滅菌鍋MLS-3750、MfⅡ全自動菌落計數儀、電子天平BS-224S、電熱恒溫水浴鍋、生化培養箱等。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 在每個樣地用無菌剪刀和刮皮刀分別采集健康的枝條、樹干（樹皮），感病的枝條、樹干（樹皮）和感病嚴重的枝條若干，分別裝入滅菌紙袋內并進行編號。感病等級根據樹干或枝條上的病斑數量判斷，病斑數量≤10個，且樹木長勢正常的為“感病”的；病斑數≥15，樹木長勢弱的為“感病嚴重”的。

1.2.2 內生真菌的分離

1.2.2.1 山核桃枝條內生真菌的分離方法 將山核桃枝段組織切成段，混合后隨機取10支，先用清水洗凈，然后將枝段切成長1.0～1.5 cm的短段，再進行表面消毒：用5%次氯酸鈉液處理5 min，無菌水沖洗，75%酒精處理2 min，無菌水沖洗，無菌吸水紙吸干，75%酒精處理1 min，無菌水沖洗3～5次，最后用無菌吸水紙吸去表面水，取最后1次無菌水洗液涂于三塊平板上培養，在恒溫培養箱中25℃培養3～4d，觀察有無菌落產生，若發現皿中無菌落生成，則證明該材料表面消毒徹底，否則，不能使用。隨機選取組織塊接入PDA平板培養基上，每皿接3塊，每樣接3皿，將培養皿放在28℃恒溫箱內培養。依據菌落形態特征，依據參考文獻[10]進行鑒定。

1.2.2.2 山核桃樹干（樹皮）內生真菌的分離方法 將山核桃樹干組織切成塊，混合后隨機取10塊，先用清水洗凈，然后將樹干組織分割為0.5 cm×0.5 cm的組織塊。表面消毒方法同上，將消毒后的干皮組織縱剖為4～6份，隨機選取接入PDA平板培養基上，每皿接3塊，每樣接3皿，將培養皿放在28℃恒溫箱內培養。依據菌落形態特征，依據參考文獻[10]進行鑒定。

1.2.3 山核桃內生真菌對山核桃干腐病的抑制作用 采用對峙培養法研究山核桃內生真菌與干腐病之間的相互關系。選取幾種優勢內生真菌活化培養5 d后，取直徑為0.5 cm內生真菌和山核桃干腐病病原菌的菌絲塊接種于PDA平板上距中心2 cm處同一直線的兩點上，同時設接種病原菌為對照，每處理3個重復，于25℃恒溫培養，逐日觀察抑菌作用。病原菌與拮抗菌落相交之后，觀察記錄拮抗菌對病原菌的包圍、抑制、寄生及侵入病菌菌落，占領其營養空間的過程，挑取相交界面處的菌絲鏡檢觀察，并且每日用MfⅡ全自動菌落計數儀測量內生真菌的菌落直徑、病原菌的菌落直徑以及只接病原菌的對照直徑比較。按以下公式計算病菌的生長抑制率。

2 結果與分析

2.1 內生真菌分離結果

在實驗過程中，前期對各個樣品進行了內生真菌的分離及培養，其中仙霞樣品分離出了13種內生真菌，橫路樣品分離出了15種內生真菌。從兩地分離到的內生真菌編號如表1。

從表1可以看出，山核桃內生真菌的種類在感病與不感病植株以及同一植株的不同部位呈現一定的差異性，感病樹干（枝條）上的內生真菌數相對要高一些；橫路采集到的樣品中內生真菌數量比仙霞樣品稍多。

表1 仙霞和橫路樣地分離到的內生真菌Table 1 Fungal endophytes isolated from hickory collected in Zhejiang and Anhui

2.2 兩點對峙培養結果

采用兩點對峙法測定了上述內生真菌對山核桃干腐病的生長抑制作用。其中，仙霞樣品中X-1、X-2、X-4、X-6、X-8、X-10這6種內生真菌以及橫路樣品中H-1、H-2、H-7、H-9這4種內生真菌在對峙實驗中明顯比山核桃干腐病病原菌生長慢，對病原菌無抑制作用，故不予進行下一步實驗及分析。其余內生真菌的對峙培養中，山核桃干腐病病原菌的生長情況見表2。

表2 對峙培養中山核桃干腐病病原菌直徑Table 2 Diameter of B. dothidea during face-to-face culture

由表2可知，仙霞樣品中X-5、X-7在72 h內均對山核桃干腐病病原菌有抑制作用；橫路樣品中H-3在72 h內對山核桃干腐病有明顯抑制作用，而H-6、H-10、H-11的生長速度與山核桃干腐病差不多，其余內生真菌對山核桃干腐病均無抑制作用。

2.3 內生真菌對山核桃干腐病菌的生長抑制作用

病菌生長抑制率，見表3。

表3 內生真菌山核桃干腐病病菌的生長抑制效果Table 4 Inhibitive effect of isolated endophytes agaist B. dothidea

由表3可知，仙霞樣品中X-5對山核桃干腐病的抑制作用分別為45.32%、34.98%、28.61%，X-7對山核桃干腐病的抑制作用分別為10.73%、23.03%、12.01%；橫路樣品中H-3對山核桃干腐病的抑制作用分別為49.72%、44.30%、32.03%，H-10、H-6、H-11在對峙培養的后期出現比較弱的抑制作用。

3 討論

本研究對山核桃主產地臨安和寧國的兩個山核桃干腐病高發區不同感病等級的山核桃樹組織中內生真菌進行分離，研究發現，感病山核桃枝條、樹干的內生真菌種類略大于健康山核桃植株中的內生真菌數量。但這一結果可能具有隨機性，因為本試驗在山核桃內生真菌的分離過程中，僅采用了一種PDA培養基去分離培養山核桃內生真菌，這就導致不能在 PDA培養基上很好的真菌無法分離到；同時，5%次氯酸鈉液處理材料時間的長短以及溫度，濕度等都有可能影響內生真菌的分離率。因此，多季節、多地點、多植株采樣、多種方式純化分離有助于得到更多抑制作用明顯的山核桃內生真菌。

本研究采用兩點對峙法測定了山核桃內生真菌對山核桃干腐病的生長抑制作用，發現有3種內生真菌對山核桃干腐病有明顯抑制作用。這是首次報道山核桃內生真菌資源及其生物防治作用，為探索山核桃干腐病的生物防治方法提供了理論依據。這3種內生真菌具體的分類地位、對山核桃干腐病起抑制作用的活性物質及抑制作用機理有待進一步研究。

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Preliminary Research on Fungal endophytes Inhibition of Canker Disease of Carya cathayensis

ZHU Cheng-qi，ZHOU Le，SU Xiu*
（School of Forestry & Biotechnolog, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China）

PDA medium was used for isolating fungal endophytes from different diseased organs of hickory (Carya cathayensis) collected from Lin’an of Zhejiang and Ningguo of Anhui province on April 12, 2014. Total of 28 strains fungal endophytes were isolated. Determinations of inhibition of isolated endophytes against canker disease (Botryosphaeria dothidea) were conducted by face-to-face culturing on PDA medium. The result demonstrated that 3 strains of endophytes (numbered X-5, X-7 and H-3) had significant inhibition effect against B. dothidea. In the first three days of culturing, the inhibition rate of X-5 was 45.32%, 34.98%, 28.61% per day, that of X-7 was 10.73%, 23.03%, 12.01% per day, and that of H-3 was 49.72%, 44.30%, 32.03%.

canker disease of Carya cathayensis; fungal endophytes; biological control

S763.15

B

1001-3776（2015）02-0058-04

2014-06-06；

2015-01-25

浙江農林大學科研發展基金項目（2013FK019）；浙江農林大學創新創業訓練計劃項目（201302013）

朱誠棋（1992-），男，浙江桐鄉人，從事森林保護學研究；*通訊作者。