菩人丹超微粉對糖尿病大鼠視網膜細胞間黏附分子-1表達的影響

菩人丹超微粉對糖尿病大鼠視網膜細胞間黏附分子-1表達的影響

崔秀成董志軍

(承德醫學院附屬醫院眼科，河北承德067000)

摘要〔〕目的探討探討菩人丹超微粉(PRD)對糖尿病大鼠視網膜細胞間黏附分子(ICAM-1)表達的影響。方法36只Wistar大鼠隨機分為3組，正常對照組、糖尿病模型組和PRD治療組，每組12只。糖尿病模型組和PRD治療組大鼠均采用鏈脲佐菌素連續腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型。模型成功建立后，PRD治療組大鼠給予PRD灌胃，時間為3個月。采用SP免疫組織化學染色法、Western印跡法檢測視網膜ICAM-1蛋白的表達；逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測視網膜ICAM-1 mRNA的表達。結果糖尿病模型組與正常對照組比較，大鼠視網膜ICAM-1蛋白及mRNA表達均明顯升高(P<0.01)，PRD治療組與糖尿病模型組比較，大鼠視網膜ICAM-1蛋白及mRNA表達均明顯降低(P<0.01)。結論PRD可通過下調ICAM-1的表達，抑制糖尿病大鼠視網膜炎癥反應，發揮對糖尿病視網膜損傷的保護作用。

關鍵詞〔〕菩人丹超微粉；糖尿病視網膜病變；細胞間黏附分子-1

中圖分類號〔〕R774.1〔

基金項目：河北省中醫藥管理局資助項目(2014066)

通訊作者：董志軍(1978-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事糖尿病視網膜病變的研究。

第一作者：崔秀成(1964-)，男，副主任醫師，主要從事糖尿病眼病研究。

糖尿病視網膜病變(DR)是常見的糖尿病微血管并發癥，是導致不可逆性盲的重要原因之一〔1，2〕。研究表明〔3〕，細胞間黏附分子(ICAM)-1介導的炎癥反應在DR的發生發展中起重要作用，抑制眼內ICAM-1失衡是DR防治的重要靶方向。菩人丹超微粉(PRD)針對糖尿病病機關鍵“熱、虛、瘀”，依據傳統方，并結合臨床研究及現代藥理學研究成果，確立以苦瓜為君藥，人參、丹參為臣藥，葛根、何首烏、水蛭為佐使藥的菩人丹中藥組方。諸藥協同，益氣養陰，調暢氣血，化瘀通絡。現代藥理研究證實PRD具有抑制氧化應激、對抗細胞凋亡和衰老、改善微循環、促進組織修復與再生等作用〔4〕。前期研究證實：PRD能有效修復2型糖尿病大鼠損傷的胰島β細胞、降低血糖，并具有保護糖尿病并發的大血管、微血管病變等作用〔4，5〕。本文旨在通過觀察PRD對糖尿病大鼠視網膜ICAM-1表達的影響，探討PRD對糖尿病大鼠視網膜炎癥病變的保護作用。

1材料與方法

1.1藥物與試劑PRD由苦瓜、人參、丹參、制首烏、葛根、水蛭按10∶1∶3∶1∶1∶0.3的比例組方提取而成，每1 g超微粉相當于8～15 g生藥，由中央民族大學中國少數民族醫學研究院提供；鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司；Trizol，美國Invitrogen公司；ICAM-1兔抗多克隆抗體，武漢博士德生物工程公司；ICAM-1引物，上海生工公司；SP免疫組化試劑盒，北京中杉金橋生物技術公司；蛋白定量試劑盒，北京索萊寶生物科技有限公司；RT-PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。

1.2實驗動物清潔級雄性Wistar大鼠〔北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號：SCXK(京)2006～0009〕，體質量200～250 g。動物的飼養和實驗過程遵循中國科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。

1.3動物模型制備及分組將36只大鼠應用隨機數字表法進行完全隨機化分組，分為正常對照組、糖尿病模型組和PRD治療組，每組12只。糖尿病模型組、PRD治療組大鼠均采用質量分數2% STZ(25 mg·kg-1·d-1)腹腔注射建立糖尿病動物模型，每日注射1次，連續3 d，以血糖≥16.7 mmol/L作為成模標準〔6〕。模型成功建立后，模型組大鼠不做任何處理；按體表面積折算確定PRD治療組大鼠給藥劑量為每日1.8 g/kg，連續灌胃3個月。

1.4標本制備給藥結束后，10%水合氯醛腹腔麻醉(0.5 g/kg)大鼠，迅速取出雙側眼球。一側眼球浸于4%多聚甲醛固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，備用于免疫組織化學染色；另一側眼球迅速在動物手術顯微鏡下冰面上鈍性分E離視網膜，投入液氮中保存，分別備用于Western印跡及RT-PCR檢測。

1.5免疫組織化學染色檢測ICAM-1蛋白的表達眼球平行視神經連續矢狀切片，片厚4 μm，采用SP免疫組織化學染色法檢測視網膜ICAM-1蛋白表達。 一抗稀釋濃度均為1∶100，DAB顯色，蘇木素復染細胞核。以0.01 mmol/L PBS代替一抗作為陰性對照，以胞質中出現棕黃色顆粒為陽性反應。

1.6Western印跡檢測視網膜ICAM-1蛋白的表達取液氮中保存的視網膜組織，提取蛋白質，以BCA蛋白試劑盒定量蛋白濃度。蛋白上樣量為50 μg，12% SDS-PAGE凝膠電泳，80～120 V、2 h，電泳完畢后轉移至硝酸纖維素膜；5% 脫脂奶粉TBST封閉2 h；加入1∶200稀釋的ICAM-1抗體，4℃過夜；洗膜后用1∶5 000稀釋的二抗辣根過氧化物酶(HRP)交聯物室溫搖床孵育1 h；Super ECL Plus超敏發光液顯影。采用Quantity One-4.6.2軟件對顯影條帶進行分析，以ICAM-1條帶與β-actin條帶的灰度比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.7RT-PCR法檢測視網膜ICAM-1 nRNA表達視網膜組織，在液氮中碾磨成粉末，按Trizol總RNA抽提說明書操作，提取視網膜組織的總RNA。取5 μl RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳，可見明顯的28 s、18 s和5 s三條完整的條帶，說明抽提的總RNA比較完整；紫外分光光度計檢測OD260/OD280值為1.9～2.1，說明RNA沒有被污染。取3 μg總RNA為模板逆轉錄成cDNA，反應條件為：30℃，10 min；55℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5min。PCR反應條件：94℃，2 min；94℃，30 s；50℃～65℃，30 s；72℃，1 min，第二步起循環。ICAM-1引物序列為：正義鏈：5’ ACCCACCTCACAGGGTACTTC 3’，反義鏈：5’ GAGTCTGCTGAGACCCCTCTT 3’，退火溫度為60℃，29個循環，產物大小為233 bp；β-actin引物序列為：正義鏈:：5’CATCCTGCGTCTGGACCT 3’，反義鏈：5’TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3’，退火溫度為58℃，29個循環，產物大小為480 bp。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，采用ZF型紫外透射反射分析儀攝像，并用Quantity One-4.6.2軟件進行定量分析，以目的條帶的光密度與β-actin條帶光密度的比值，作為ICAM-1 mRNA表達的相對水平。

1.8統計學方法采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2結果

2.1免疫組織化學檢測結果ICAM-1免疫陽性產物位于胞質，呈棕黃色顆粒狀，免疫陽性細胞主要分布于視網膜神經節細胞層及內核層。糖尿病模型組ICAM-1陽性產物表達明顯強于正常組，胞漿呈深棕黃色；PRD治療后，ICAM-1陽性產物表達較模型組減弱，胞質呈棕黃色。

2.2Western印跡法檢測結果在蛋白Marker的97 kD、43 kD水平處，分別可見ICAM-1的蛋白條帶及β-actin條帶。糖尿病模型組與正常對照組比較，大鼠視網膜ICAM-1蛋白表達明顯升高(P<0.01)；PRD治療組與糖尿病模型組比較，大鼠視網膜ICAM-1蛋白表達明顯降低(P<0.01)。見表1。

2.3RT-PCR檢測結果在DNA Marker的233 bp、480 bp水平處分別可見清晰的ICAM-1及β-actin mRNA條帶。糖尿病模型組與正常對照組比較，大鼠視網膜ICAM-1 mRNA表達明顯升高(P<0.01)；PRD治療組與糖尿病模型組比較，大鼠視網膜ICAM-1 mRNA表達明顯降低(P<0.01)。見表1。

表1　各組大鼠視網膜ICAM-1蛋白及

與糖尿病模型組比較：1)P<0.01

3討論

視網膜微血管系統的損害是DR的重要特征，血-視網膜屏障(BRB)功能障礙和視網膜新生血管形成是DR的主要病理改變，是導致DR患者視力損害的主要血管性因素〔7〕。近年的觀點認為DR是一種由代謝紊亂引起的炎癥性疾病，炎癥因子過度表達介導的炎癥反應在糖尿病視網膜微血管損傷中起到了關鍵作用，特別是ICAM-1被認為是與DR聯系緊密的炎癥因子〔8〕。

ICAM-1是一種對免疫反應、炎癥反應有重要調節和介導作用的炎癥因子〔9〕。正常生理情況下，低濃度的ICAM-1及其配體在維持正常組織結構，參與細胞凋亡、增殖過程中起重要作用。Zhu等〔10〕研究表明，在STZ致糖尿病大鼠模型的視網膜組織中的ICAM-1表達異常升高，應用ICAM-1抑制劑后可以改善高血糖時視網膜炎性病變，提示ICAM-1在DR微血管病變過程中發揮重要作用。

本研究發現，糖尿病模型大鼠視網膜ICAM-1蛋白和mRNA的表達均明顯增高。糖尿病時慢性高血糖可引起代謝發生異常，導致視網膜毛細血管結構和功能破壞，引起視網膜血流動力學改變，視網膜處于缺血、缺氧狀態，細胞內活性氧產生，導致視網膜氧化應激、局部炎癥反應增強，進而誘導強有力的炎癥分子ICAM-1表達異常升高，高表達的ICAM-1使白細胞淤滯，白細胞黏附可引起視網膜毛細血管內皮細胞的凋亡，激活血小板，導致血流緩慢和血栓形成、毛細血管無灌注的形成及血視網膜屏障破壞，從而促進DR的發生發展〔8〕。

本研究表明PRD可通過下調視網膜組織ICAM-1的表達，減少視網膜微血管滲漏及病理性新生血管生成，發揮對糖尿病視網膜微血管損傷的保護作用。由于PRD可發揮中藥組方多環節、多靶位的治療優勢，且對人體無毒性，避免了化學合成藥物帶給人體的不良反應，因此可能為DR治療提供新的方法。

4參考文獻

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〔2013-08-12修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)