隨機ssDNA文庫不對稱PCR擴增條件的優化及回收效率比較

周晏丞，曹立亭，陳 露，馬 躍

（西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶 榮昌 402460）

20世紀90年代誕生了一種新興的科學技術，它利用人工合成的大容量隨機寡核苷酸文庫與靶分子在體外的相互作用，篩選出一種與傳統抗體相比特異性更強、親和力更大、性質更穩定以及制備更容易，無免疫原抗性，無批間差異的適配子[1]，該技術稱之為指數富集的配基系統進化技術（SELEX）。SELEX技術打破了傳統的核苷酸配對的思想，稱得上是核酸研究與應用領域的里程碑式進步。其原理是利用大容量的隨機單鏈寡核苷酸文庫進行體外多輪篩選、擴增，并最終獲得與非核酸靶分子高親和力、高特異性結合的寡核苷酸序列[2]。SELEX技術篩選出的適配子不僅分子量小、配體廣泛、體外篩選不依賴于實驗動物，甚至可以進行多種修飾，比如最為普遍的糖環修飾、堿基修飾和磷酸修飾等[3]，這些優勢使得SELEX技術有望成為實驗室和臨床診斷、治療的主要技術之一。

隨機寡核苷酸是SELEX篩選技術的基礎，而隨機寡核苷酸鏈中間存在一段隨機序列，由于該隨機區的存在使文庫中的核酸序列極為豐富，給篩選過程中文庫的PCR擴增帶來了一系列問題，導致非特異性擴增[4]得不到理想的隨機ssDNA，而常規的試劑盒回收方法對小片段分子回收效率極低，影響整個篩選過程。針對上述問題，本試驗在對稱PCR最佳優化條件的基礎上對隨機ssDNA文庫的不對稱PCR反應體系進行了優化，并且比較了PCR產物不同純化方法的回收效率，以期為SELEX技術中構建亞文庫以及篩選特異性更強的適配子奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 隨機ssDNA文庫：構建長度為80nt的隨機ssDNA文庫，ssDNA文庫序列：5′-CTGGAGCG TCCTGGGGCGTCN（40）GTGCCCTCGCTCCGACCAGC-3′，兩端為固定序列，中間 N（40）為隨機序列。

PCR擴增引物：上游引物5′-CTGGAGCGTCCTG GGGCGTC-3′，下游引物 5′-GCTGGTCGGAGCGAGG GCAC-3′。隨機文庫及引物均由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.1.2 試驗試劑 MgCl2、Taq DNA Polymerase、dNTP、10×PCR Buffer，均購自大連寶生物工程有限公司。其他試劑：異丙醇、4mol/L醋酸銨、70%乙醇、酚/氯仿（1∶1）、3mol/L 醋酸鈉、無水乙醇。

1.2 方法

1.2.1 隨機ssDNA文庫與合成引物的質量鑒定 將設計好的引物和ssDNA文庫交給上海英駿生物技術有限公司合成。合成的引物序列和隨機ssDNA文庫采用4%瓊脂糖凝膠電泳進行質量鑒定。

1.2.2 不對稱PCR條件優化 在前期隨機ssDNA文庫對稱PCR反應體系[5]優化結果的基礎上，參照文獻[6]報道的方法對隨機ssDNA文庫的不對稱PCR擴增體系進行優化，擬定的反應體系及循環條件如下：

（1）反應體系：10×PCR Buffer 2.0 μL，25 mM MgCl22.5mmol/L，dNTP Mixture 0.25mmol/L，上游引物12μmol/L，下游引物 0.6μmol/L，Taq DNA Polymerase 1.5U，ssDNA模板2.5ng，無菌水補至20μL。

（2）循環條件：94℃預變性 30 s，94℃變性 30 s，68℃退火30s，共20個循環，最后72℃延伸15s，72℃溫育7min。

其他反應組分與反應條件相同，固定下游引物投入量（0.6 μmol/L），以不同上、下游引物比例（1∶1、20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1） 分別擴增 20、30 個熱循環次數，進行3次平行試驗以驗證其穩定性。

（3）產物鑒定：PCR產物采用4%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 PCR產物回收 以1.2.2中確立的最佳循環次數和上下游引物比例進行不對稱PCR擴增，PCR擴增產物分別采用下列3種方法進行回收純化試驗，比較其回收效率。

（1）商品化試劑盒提取法：4%瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，待片段完全分離后，在紫外光下切取所需條帶，DNA在紫外燈下曝光時間不超過30s，準確稱取凝膠塊的重量，按照1g/mL Binding Buffer對應量，加入適量體積的Binding Buffer，55～60℃水浴溶解（約 7～10min），每隔 2～3min振蕩一次。溶解完成后，將DNA/凝膠混合液轉移到套有收集管的HiBind DNA 柱子上，10000×g離心1min，倒去濾液，把柱子裝回收集管；加入300μL Bind Buffer，按上述條件離心，棄去濾液，再把柱子重新裝回收集管；加入700μL SPW Wash Buffer，也按上述條件離心，棄去濾液，13000×g離心空柱2min，以甩干柱子基質。將柱子裝在干凈的EP管中，加入30～50μL經65℃預熱的Elution Buffer到柱子基質上，室溫靜置2min后，≥13000×g離心2min洗脫出DNA。回收產物加20μL DEPC水重懸，置4℃冰箱中備用。

（2）乙醇沉淀法[6]：吸取 100μL PCR 產物，12000×g離心4min，吸取上清液于1.5mL EP管中，向其中加入等體積的酚/氯仿（1∶1），混勻，置離心機中 12000×g離心5min，吸取上清液于另一干凈的1.5mL EP管中，加入0.1倍體積的3mol/L醋酸鈉，混勻后加入2倍體積的無水乙醇，再次混勻，-26℃下放置過夜。取出后12000×g離心30min，棄去上清液，加入1mL 70%乙醇于室溫洗滌沉淀樣品，5 000×g離心5～10 min后棄去上清液，敞開管蓋，置于室溫，直至乙醇完全揮發。沉淀的DNA樣品加入DEPC水20μL重懸，置4℃冰箱備用。

（3）不完全沉淀法[7]：吸取100μL PCR產物于干凈的EP管中，加入等體積4mol/L醋酸銨溶液，振蕩混勻，再加入等體積的異丙醇，振蕩混勻，室溫靜置10min，然后以 12000×g離心 10min，去上清，加 1mL 70%乙醇漂洗，振蕩，5 000×g離心 5～10 min，棄去上清液，再加1mL 70%乙醇振蕩混勻，4℃下12 000×g離心5 min，棄上清，室溫下干燥，加20μL DEPC水重懸，置4℃冰箱備用。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測回收效率及DNA濃度測定 分別吸取以上3種不同純化方法的純化產物各5μL進行4%瓊脂糖凝膠電泳，檢測回收效率，并測定回收前后DNA的濃度和OD260/OD280比值。

2 試驗結果

2.1 隨機ssDNA文庫及引物合成產物的質量鑒定通過4%瓊脂糖凝膠電泳得到如圖1所示的條帶，PCR擴增結果與預期相符，條帶單一，純度好，符合要求。

圖1 隨機ssDNA文庫及引物合成產物擴增結果

2.2不對稱PCR擴增條件優化通過4%瓊脂糖凝膠電泳鑒定分析，以既有較高的擴增效率又有較單一目的條帶的擴增條件為最優上下游引物比例和循環次數。結果顯示：隨機ssDNA不對稱PCR擴增的最佳循環次數為30，最佳上下游引物比例為60∶1。

2.3 待回收產物鑒定取3組PCR樣品各8 μL、Marker 3μL進行4%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示：3組樣品的條帶亮度一致，符合要求（圖2）。

2.4 回收產物檢測通過4%瓊脂糖凝膠電泳檢測商品化試劑盒、乙醇沉淀法、不完全沉淀法回收所得產物，以隨機ssDNA文庫PCR產物出現清晰的單一條帶、回收效率最高的純化方法為最佳回收方法。結果顯示：對短片段ssDNA回收效率最佳的是乙醇沉淀法，其次是不完全沉淀法，最后為商品化試劑盒提取法。

用核酸蛋白測定儀測定回收前后ssDNA的濃度，結果見表1。比較3種方法的回收效率，可見乙醇沉淀法與不完全沉淀法差異顯著，乙醇沉淀法與商品化試劑盒法差異極顯著，不完全沉淀法和商品化試劑盒法差異極顯著。

圖2 待回收產物的擴增結果

表1 3種純化方法的比較

用紫外分光光度計測定3種方法回收產物的OD260/0D280值，結果見表1。當0D260/OD280=1.6～1.8時，可以認為該ssDNA純度較好。從表1可知，這3種純化方法所得純化產物的質量均在標準范圍以內，其中乙醇沉淀法的純化效率最高。

4 分析與討論

理論上，SELEX技術結合PCR擴增技術以指數富集與靶分子特異性結合的寡核苷酸，經過幾輪甚至十幾輪的篩選，可以獲得親和力高、特異性好的靶分子，但是在實際操作中還是存在篩選效率低的問題。PCR技術始終貫穿著適配子篩選的全過程，PCR擴增效率的高低也會直接影響適配子的特異性和高效性，制備下一輪篩選文庫的方法一般有不對稱PCR法和生物素-鏈親和素磁珠分離法[8]，雖然應用磁珠法獲得的ssDNA純度好，但是磁珠法耗材較為昂貴，不為實驗室所廣泛采用，因而成本較低、方法簡單的不對稱PCR法應用得更為廣泛。同時，隨機ssDNA文庫隨機區的存在也使得文庫具有多樣性，當以ssDNA為模板進行PCR擴增時，隨著循環次數的增加，非特異性擴增產物也會增加[9]。為保證亞文庫的純度和數量，對不對稱PCR擴增條件的優化就顯得尤為重要，尤其是對循環次數和上下游引物比例的優化。本試驗中，以30個循環為最佳熱循環次數，既可以獲得高質量的ssDNA文庫，又能較好地避免非特異性產物的擴增，且結果穩定。在一般的不對稱PCR擴增中，合適的上下游引物比例一般在50∶1～100∶1之間，過低的引物比例容易引起非特異性擴增，而過高的引物比例則會使擴增效率下降[10]。本試驗得出的最佳上下游引物比例為60∶1。

PCR擴增產物中一般都含有過量的酶和引物等，會影響后續的連接、篩選等操作過程[11]，因而擴增產物的純化是非常有必要的。常規的回收純化方法一般為商品化試劑盒提取法，但是試劑盒對＜500bp的目的片段的回收效率非常低，而且商品化試劑盒價格昂貴。本研究結果表明，乙醇沉淀法對小片段DNA分子的回收效率及純化效果均比較好，但是不能完全分離產物中的單雙鏈，導致回收產物中仍含有dsDNA；試劑盒提取法所得產物中，含有dsDNA較少，卻存在回收效率低的問題。

5 結論

本研究得出20μL體系ssDNA文庫不對稱PCR的最佳擴增條件為30個熱循環，上下游引物比例為60∶1，在此條件下可以得到單純、無特異性擴增的ssDNA目的條帶。乙醇沉淀法對小片段（80nt）目的DNA的純化效果較好，對后續構建亞文庫有重要的作用。

[1] 羅正良，嚴鵬科.SELEX技術及其應用的研究進展[J].中國現代醫生，2008，46（33）：55-57.

[2] 張選矜，部寧生，范明.SELEX技術的應用及前景[J].生理科學進展，2001，32（4）：365-367.

[3] 謝海燕，陳薛釵，鄧玉林.核酸適配子及其在化學領域的相關應用[J].化學進展，2007，19（6）：1026-1032.

[4] 董俊紅，謝立蘋，王振明.SELEX技術原理及應用進展[J].濰坊醫學院學報，2005，27（5）：358-360.

[5] 曹立亭，許李麗，萬向.SELEX技術中ssDNA文庫PCR擴增條件的優化[J].安徽農業科學，2012，40（6）：3241-3242.

[6] 方念.AFP-L3核酸適配子的篩選鑒定及其對肝細胞癌診斷價值的初步研究[D].南昌：南昌大學，2008.

[7] 胡學俊，羅忠訓.乙醇沉淀法回收微量DNA效率的研究[J].湖北大學學報，1991，13（3）：284-287.

[8] Jayasena D S.Aptamers： an emerging classof molecules thatrivalantibodies in diagnostics[J].Clinical Chemistry，1999，45（9）：1628-1650.

[9]鄔芳玉.SELEX篩選AFP-L3核酸適配子方法的建立[D].南昌：南昌大學，2006.

[10]侯祺，姚朗.SELEX技術檢測小分子化學物研究進展[J].中華檢驗醫學雜志，2009，32（4）：472-474.

[11]侯義龍.PCR特異產物回收純化方法的比較[J].生物技術，2005，15（4）：36-37.