食管癌組織中CtBP2與P16INK4A的表達及其相關性分析

食管癌組織中CtBP2與P16INK4A的表達及其相關性分析*

戴曉榮，成宏偉，李瑤瑤，周瑞

(揚州大學醫學院附屬泰興市人民醫院，江蘇泰興225400)

摘要：目的：探討CtBP2與P16INK4A在食管癌組織中的表達，并且分析兩者之間的相關性。方法：使用免疫組化法(PV二步法)對我院90例食管癌患者組織中CtBP2與P16INK4A的表達進行檢測，并使用統計軟件對兩者的相關性進行分析。結果：在不同分期中，Ⅰ期和Ⅱ期患者食管癌組織中的P16INK4A陽性率為55.77%，Ⅲ期以上為18.42%，差異較為顯著(=7.176，P<0.05)；在淋巴結轉移中，CtBP2陰性和陽性的差異比較大(=10.986，P<0.01)；P16INK4A與CtBP2呈現典型的負相關關系，r=-0.417，P<0.01。結論：CtBP2可以通過抑制細胞周期抑制因子P16INK4A來實現細胞增殖，兩者對于細胞的調控是從相反的兩個方向進行的。

關鍵詞：P16INK4A;CtBP2;食管癌組織

文章編號：1006-6233(2015)10-1663-04

基金項目：*江蘇省泰州市科技支撐項目，(編號：TS2013014)

文獻標識碼：B

食管癌是全球發病率和死亡率比較高的惡性腫瘤之一，其五年生存率小于30%。對于食管癌患者需要采用手術治療輔以放療等治療手段進行治療，但其臨床效果及其預后仍然不是很理想。細胞周期負性調控因子P16INK4A的表達及修飾異常在食管癌的發生中發揮重要作用，但其在腫瘤中轉錄水平調控的具體機制還不明確。有研究表明在原代成纖維細胞中CtBP可以通過抑制P16INK4A轉錄而調控腫瘤的衰老和再生[1]。同時一些前期的研究發現，一種轉錄阻礙物CtBP2在食管癌組織中高表達，并且可能通過抑制P16的表達影響食管癌細胞的增殖和凋亡，從而提出了CtBP2對P16INK4A轉錄抑制的負性調節作用參與食管癌的發生及發展的假說[2]。本文中，試圖分析出CtBP2與P16INK4A在食管癌增殖的表達，并對其相關性進行分析，現報道如下：

1資料與方法

1.1研究對象:從2012年4月至2014年6月期間具有可行性的臨床病例標本90例。其中，標本采集均得到患者或家屬的知情同意。納入標準：所有研究患者病例均通過術后病理學或者活檢被確診為食管癌，此前無食管癌相關放化療史。排除有任何其他腫瘤診斷史。90例食管癌患者，其中男性51例，女性39例，患者年齡區間介于38～69歲，平均年齡48歲。通過查閱病史和病歷記錄的方法獲得如下數據，病例組診斷年齡鱗癌69例，腺癌21例。臨床分期Ⅰ期14例，Ⅱ期38例，Ⅲ期38例，Ⅳ期0例。出現淋巴結轉移70例，無20例。患者術前均為接受放化療，且無其他全身系統性疾病，對患者進行定期復查，并且有完整的隨訪資料記錄。

1.2藥品及儀器:藥品：甲醛溶液(化學純)，國藥集團；無水乙醇(分析純)，國藥集團；過氧化氫(化學純)，國藥集團；EDTA緩沖液，自配；磷酸緩沖鹽溶液(PBS緩沖液)，自配。儀器：電熱恒溫水浴箱，上海啟前電子科技有限公司；微波爐，上海格蘭仕有限公司；免疫組化檢測系統，上海美軒生物科技有限公司。

1.3實驗方法:P16INK4A以及CtBP2的檢測采用免疫組化法(PV二步法)[3]。采用半數計量法，200倍纖維鏡下選取8個視野，每個視野下選取200個計數細胞。細胞無顯色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。根據陽性細胞所占的比例數再按照其百分比進行分類：陽性細胞所占百分比<10%的記為1分，10%～75%記為2分，>75%記為3分。上述兩項標準的評分相乘，1分以下為陰性，大于1分的為陽性。

1.4統計學處理:采用Stata7.0統計分析軟件，SPSS13.0統計軟件對免疫組化結果進行數據分析。

2結果

2.1P16INK4A在食管癌組織中的表達,見表1。

表1　P16 INK4A在食管癌組織中的表達

根據表1可以看出，P16INK4A在不同病理分型以及淋巴結是否轉移兩個方面的差異不是很顯著，值分別為0.453，0.986，P值均大于0.05。但是，在不同分期中差異較為顯著，Ⅰ期和Ⅱ期患者食管癌組織中的P16INK4A陽性率為55.77%，Ⅲ期以上為18.42%，P<0.05，差異較為顯著。

2.2CtBP2在食管癌組織中的表達，見表2。

表2　CtBP2在食管癌組織中的表達

根據表2可以發現，CtBP2在病理分型以及病理分期兩個方面的差異不顯著，P值均大于0.05；CtBP2在淋巴結轉移這個表中，陰性和陽性的差異比較大，值達到8.986，P<0.01。

2.3食管癌組織中P16INK4A與CtBP2的相關性分析，見表3。

表3　食管癌組織中P16 INK4A與CtBP2的相關性分析

根據表3可以發現，食管癌組織中，P16INK4A與CtBP2呈現典型的負相關關系，r=-0.417，P<0.01。

3討論

真核生物基因的調控機制是當前分子生物學較為活躍的研究領域之一，而轉錄水平的調控是一個基因發揮功能的復雜過程。轉錄因子因其存在的廣泛性和調控靶基因的多樣性，與腫瘤細胞的生長、增殖、凋亡、浸潤轉移以及血管生成等各個環節密切相關。隨著對轉錄因子及其作用機制的深入研究，針對轉錄因子活化與抑制從不同環節尋找藥物作用的靶向治療以及預防與轉錄因子調控相關的腫瘤疾病[4]，已成為當今新的研究熱點，有望成為研究新型抗腫瘤藥物作用機制的有效途徑。

P16INK4A被認為是一種調控細胞周期并抑制細胞分裂的重要基因，定位于人類第9號染色體短臂2區1帶(9p21)。P16INK4A是作用于細胞分裂周期關鍵酶之一的CDK4的抑制因子，對CDk4有高度親和性，與CDk4特異性結合后，能抑制CDk4激酶活性。P16INK4A的另一種功能是誘導細胞凋亡。它在人類50%的腫瘤中失活，其中家族性黑色素瘤、膽管瘤與P16INK4A基因突變有關，P16INK4A基因位點的同源性確實常發生在神經膠質瘤、間皮瘤、鼻咽瘤和急性淋巴細胞白血病，據報道許多其他惡性腫瘤也有P16INK4A的突變和缺失[5]。因此P16INK4A在細胞增殖、分化和凋亡等活動中扮演重要角色。P16INK4A蛋白功能異常導致細胞周期的紊亂，促進細胞的失控性生長或凋亡下降，最終導致腫瘤的發生。研究證明在食管癌中P16INK4A是一個重要的臨床預后指標，食管癌中P16INK4A與腫瘤的大小、分化程度、侵襲能力及淋巴結轉移等密切相關。大多數食管癌組織中P16INK4A呈低表達，導致細胞周期失調，引發細胞過度增殖。

CtBP(C-terminal binding protein)最初是因為與E1A蛋白的C末端五個氨基酸結構域(PLDLS)結合而命名，是進化上保守的轉錄抑制因子，能與一些DNA活性蛋白特異性結合[6]，作為DNA結合蛋白與轉錄抑制酶之間的橋梁，進而抑制基因轉錄。近年來研究表明CtBP可以通過抑制上皮型鈣黏蛋白E-cadherin表達而促進上皮間質轉化(EMT)，也可以通過發揮轉錄輔阻遏物的作用負性調節一些腫瘤抑制因子從而產生致癌作用，所以CtBP也被認為是一個抗凋亡因子。CtBP2被研究最多的功能是作為短距離的轉錄抑制物。一般認為其是通過直接與能夠和DNA結合的轉錄因子或連接蛋白相互作用進而被募集至啟動子來抑制基因的表達，然而其作用的具體機制還不清楚。

從本文成果來看，CtBP2作為一種轉錄抑制因子，能夠成功抑制P16的活性，兩者呈現典型的負相關現象，并且P<0.01，很顯著。說明CtBP2可以通過抑制細胞周期抑制因子P16INK4A來實現細胞增殖。它和P16INK4A對細胞周期的調控是從兩個相反的方向參與的。過高的CtBP2表達會嚴重影響P16INK4A啟動子，對P16INK4A的表達產生下調作用，對P16INK4A的活性產生抑制。

參考文獻：

[1]Kovi RC, Paliwal S, Pande S, et al. An ARF/CtBP2 complex regulates BH3-only gene expression and p53-independent apoptosis[J].Cell Death Differ, 2010，(3):53～58.

[2]吳新民.CtBP2在大鼠創傷性損傷腦中的表達及意義[J].南通大學學報，2010,(2)：34～36.

[3]劉薇,王言奎,楊慧英,等.宮頸癌組織NDRG1與P16蛋白表達及其意義[J].齊魯醫學雜志,2012,27(4).309～313.

[4]Lee W, Swarup S, Chen J, et al. Homeodomain-interacting protein kinases (Hipks) promote Wnt/Wg signaling through stabilization of beta-catenin/Arm and stimulation of target gene expression[J].Development, 2009,(2)：24～27.

[5]Yuchan Wang, Fang Liu, Feng Mao.Interaction with Cyclin H/Cyclin-dependent Kinase 7 (CCNH/CDK7) Stabilizes C-terminal Binding Protein 2 (CtBP2) and Promotes Cancer Cell Migration[J].Biol Chem,2013,(3)：31～36.

[6]葉曉霞,石彥,霍克克,等.羧基末端結合蛋白CtBP2與泛素結合酶UBE2的相互作用[J].第三軍醫大學學報,2011,33(17).