遼寧省某種豬場氟烷基因的檢測

趙世偉 張守純

生活水平的提高，導致消費者對優質豬肉的要求越來越高，豬肉品質主要受到遺傳與環境效應綜合作用的影響。目前，豬肉品質已經成為豬種選育的重要指標。氟烷基因（Halothane，Hal）是導致豬應激綜合癥的一個主效基因，而豬應激綜合癥直接導致PSE肉或DFD肉的產生。為此，國內外的研究人員對氟烷基因作了細致、深入研究，以降低或消除豬應激綜合癥導致養豬業的損失，從而提高經濟效益，為消費者提供更多的優質豬肉。

研究人員通過對氟烷基因cDNA序列的進一步分析，發現該基因的1843位點的堿基發生了突變（“C”→“T”），而該堿基的突變導致該位點密碼子編碼的氨基酸由精氨酸變成了半胱氨酸，使得Ca2+釋放通道的結構發生了變化，功能也出現了異常。當豬受到應激時，Ca2+會大量的釋放，引起肌肉持續收縮產生應激綜合征。進一步的研究發現，該位點堿基的突變使得該基因的限制性酶切識別位點由HalN（-5GCG↓C 3-）變為Haln（-5 GTGCT↓G 3-）。

用HhaⅠ酶對該位點酶切，經瓊脂糖凝膠電泳分析后能觀察到3種帶型，分別為基因型HalNHalN的顯性純合子帶型、基因型HalNHaln的雜合子帶型以及基因型HalnHaln的隱性純合子帶型，其中基因型為HalnHaln的豬為應激敏感豬。在種豬場氟烷基因的檢測中，采用PCR-RFLP技術，既廉價又能準確的檢測出Haln的存在，準確率可達100%，檢測樣本只需采集種豬的少量血液和肌肉組織等。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

PCR基因擴增儀（杭州博日

科技有限公司），電泳槽DYCZ

-25D、電泳儀DYY-10C（北京

六一儀器公司），2×PCR Mast

erMix（康為世紀生物科技有限

公司），HhaⅠ酶、氟烷基因引

物序列（上海生工生物工程有限

公司）：F（5-TCCAGTTT

GCCACAGGCCA-3）、R（

5-ATTCACCGGATGG

AGTCTCTGAG-3）。

1.2 材料

遼寧省某種豬場312頭種豬的耳組織（綠豆粒大小）。

1.3 方法

本試驗使用經典的酚—氯仿法提取312頭種豬耳組織的總基因組DNA，提取完成的總基因組DNA充分溶解于滅菌去離子水中后，于-20℃保存備用。

1.3.1 Hal基因PCR擴增反應體系（20微升）10微升 2×PCR MasterMix，2微升豬耳組織的總基因組DNA，上游引物和下游引物各1微升，6微升超純去離子滅菌水。Hal基因PCR擴增反應條件為：94℃預變性5分鐘，30次循環（94℃，45秒；58℃，45秒；72℃，45秒），最后72℃10分鐘。Hal基因的PCR擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果為陽性的PCR擴增產物進行酶切。

1.3.2 酶切反應體系 （15微升）HhaⅠ酶1微升，10×Buffer 1.5微升，Hal基因的PCR擴增產物10微升，滅菌去離子水2.5微升。在37℃水浴中孵育4小時后，酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

豬基因組總DNA1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，本試驗提取的基因組總DNA純度較高，且濃度較大（見圖1）。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測的Hal基因PCR擴增產物條帶大小約為659bp（見圖2），與目的條帶一致，而且無非特異性條帶的出現。

Hal基因酶切產物的電泳結果存在3種帶型（見圖3），即基因型為HalNHalN的顯性純合子帶型（2條帶：493bp、166bp）、基因型為HalNHaln的雜合子帶型（3條帶：659bp、493bp和166bp）以及基因型為HalnHaln的隱性純合子帶型（1條帶：659bp）。本試驗檢測的312頭種豬中基因型為HalnHaln的隱性純合子3頭，基因型為HalNHaln的雜合子34頭，其余均為HalNHalN的顯性純合子。含有Haln基因的種豬頭數占檢測豬群的11.9%，Haln基因頻率為6.4%。

3 討論與結論

在養殖過程中，基因型為HalNHalN的顯性純合子不表現應激綜合征，基因型為HalnHaln的隱性純合子表現出應激綜合征，而基因型為HalNHaln的雜合子，則部分表現為應激綜合征。因此，在養殖過程中簡單的通過應激綜合征的表現來決定種豬的選留并不能從根本上淘汰Haln基因，而本試驗采用的檢測技術能從分子水平準確的判斷種豬的選留，保障養豬業的經濟效益。

由于本豬場的種豬大部分為引進豬種，說明在引種的過程中引入Haln基因，該基因在后續的擴繁中將會直接影響該種豬場的經濟效益，需要及時淘汰攜帶Haln基因的種豬。并建立完善的種豬繁育體系，生產高品質、高性能的商品豬，為消費者提供更優質的豬肉。