針藥結合療法對帕金森病模型小鼠紋狀體區多巴胺D1、D2受體活性的影響

針藥結合療法對帕金森病模型小鼠紋狀體區多巴胺D1、D2受體活性的影響

陳潔1，姜超2，陸征宇1，張琦君1

摘要：目的探討針藥結合療法對帕金森病(PD)模型小鼠紋狀體區多巴胺D1、D2受體活性的影響。方法將C57B L/6雄性小鼠隨機分為正常組、模型組、針刺組、中藥組、西藥組及針藥結合治療組，每組再隨機分為7天組(n=7)和14天組(n=7)，應用腹腔內注射(MPTP)的方法制備PD模型小鼠。針刺組針刺百會、運動前區(雙側)、啞門；西藥治療組灌胃美多巴；中藥組灌胃中藥PD方；針藥結合組針刺和中藥同時施行，方法同中藥組和針刺組。用免疫組化法觀察治療后PD模型小鼠腦內紋狀體區多巴胺(DA)D1、D2受體活性的影響。結果針藥結合組、西藥治療組小鼠腦內紋狀體區DA的D1、D2受體活性與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。西藥治療PD模型小鼠，其模型小鼠紋狀體區D1、D2受體活性改善最佳，最接近正常組D1、D2受體活性指標。針藥結合治療改善PD模型小鼠紋狀體區D1、D2受體活性優于單純中藥治療及針刺治療。結論西藥美多巴治療PD，改善該病多巴胺D1、D2受體活性且具有明顯優勢，針藥結合對PD的治療優于傳統單純中藥治療及針刺治療。

關鍵詞：帕金森病；針藥結合療法；免疫組化；多巴胺；小鼠

中圖分類號：R742R285

收稿日期：(2014-10-05)

Effects of Acupuncture Combined with Herbar Medichines on Striatal Dopamine D1 and D2 Receptor Activity in Mice with Parkinson’s Disease

Chen Jie，Jiang Chao，Lu Zhengyu，Zhang Qijun

Yueyang Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200433，China

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of acupuncture combined with herbal medicine on striatal neurotransmitters dopamine (DA) of D1 and D2 receptor activity in mouse with Parkinson's disease(PD).MethodsTwenty-eight adult male C57B L/6J mice were randomly divided into normal control group，PD model group，acupuncture group，herbal medicine group，western drug group，and acupuncture and herb combination group.Each group was divided into 2 subgroups，the 7-day and 14-day(n=7).The PD models were established with intraperitoneal injections of MPTP in C57/BL mice.The mice in acupuncture group were applied to Baihui，section of premotor area(both sides)，Yamen The mice in western drug group were treated with madopa.The mice in herbal medicine group were treated with PD prescription.The mice in acupuncture and herb combination group were treat with both acupuncture and herbal medicine.The effect of striatal neurotransmitters DA of D1 and D2 receptor activity were measured by immunohistochemical method after treatment.ResultsThere were significant differences on striatal neurotransmitters DA of D1 and D2 receptor activity among the acupuncture combined with herbal medicine group，the western drug group and the normal control group(P<0.01).The striatal neurotransmitters DA of D1 and D2 receptor activity demonstrated a significant improvement in western drug group comparing to other groups.The striatal neurotransmitters DA of D1 and D2 receptor activity demonstrated a significant improvement in the acupuncture combined with herbal medicine group，which comparing to the acupuncture group and the herbal medicine group. ConciusionMadopa can effectively improve the striatal neurotransmitters DA of D1 and D2 receptor activity.The acupuncture and herb combination group was more significant than the acupuncture group and the herbal medicine group in improvement of the striatal neurotransmitters DA of D1 and D2 receptor activity.

Key words：Parkinson’s disease；acupuncture combined with herbal medicine；Mice

作者單位：1.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院(上海 200433)，E-mail：happycatl@126.com；2.陜西中醫學院附屬醫院

帕金森病(PD)是一種以黑質多巴胺能神經元(NDN)特征性缺失，廣泛累及中樞神經系統、癥候復雜多樣的慢性神經元變性疾病。目前，關于PD的研究表明其與遺傳因素、環境因素、興奮性毒性與鈣的細胞毒作用、線粒體功能障礙與氧化應激過度、免疫學異常、年齡老化、細胞凋亡、泛素蛋白酶體系統功能障礙、多聚 ADP核糖聚合酶過度活化等諸多因素有關，然根本發病機制尚未完全闡明[1]。L-dopa制劑目前仍被認為是治療PD的金標準，可明顯改善PD癥狀，但50%～80%的PD患者在服藥后平均4.1年的時間里，出現了運動并發癥[2]。多巴制劑除了在自身代謝過程中可引起諸多副反應外，有報道認為其代謝過程中產生的代謝產物本身就可誘發神經元凋亡[3，4]，從而破壞尚未受損的NDN及其通路，加速病程進展。因此，盡量推遲多巴制劑的應用，探索神經保護治療方案已成為目前PD研究的新熱點，可見現代醫學對本病也缺乏根治的手段。

帕金森屬中醫學“顫證”“內風”等范疇，中醫藥在治療本病中具有改善癥狀，延緩病程，提高生活質量，減少西藥用量及其副反應，增強體質，提高抗病能力等優勢。中藥可輕度的抗僵直、抗震顫，調節黑質、紋狀體中抗氧化應激的酶系統，增強抵抗自由基的能力，保護黑質神經元；針刺可調節腦內中樞通路的神經遞質含量，尤其針刺后，可增加DA的含量。并且中醫藥特有的整體治療特點，調整人體氣血陰陽，使之趨于平衡，協調人體臟腑功能而改善癥狀。這種標本兼治的特點，西藥難以具有，可彌補西藥治療的不足，和西藥治療有很大的互補性，可見挖掘中西醫綜合治療PD很有必要。

本研究采用腹腔內注射MPTP制備PD小鼠模型，觀察針藥結合療法對PD模型小鼠紋狀體區多巴胺D1、D2受體活性的影響，而為臨床研究提供進一步的實驗依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物清潔級C57B L/6J雄性小鼠，8周齡，雄性，體重20 g±2 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物許可證號：SCXK(滬)2007-0005，置于室溫18 ℃～21 ℃、相對濕度45%～55%、12 h晝夜周期的動物室內。7只/籠，自由進食、飲水。

1.1.2實驗藥品及主要儀器1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫毗睫(MPTP )，美國Sigma公司。抗小鼠D1、D2受體免疫組化試劑盒(上海麥莎生物科技有限公司)。中藥：炙黃芪60 g，山萸肉60 g，天麻18 g，鉤藤30 g，丹參30 g，羚羊角粉1.2 g。所有藥材均購自上海中醫藥大學岳陽醫院中藥房。根據文獻[5]方法制成4.16 g/mL益氣養陰、熄風化瘀的PD方水煎液，0.1 mPa滅菌15 min，4℃保存備用。將美多巴批號SH0434，上海羅氏制藥有限公司)。制備成相當于臨床等效劑量10倍的水溶液0.002 5 g/mL，隨配隨用。華佗牌無菌針灸針(0.5寸毫針，直徑0.25 mm，蘇州醫療用品廠有限公司)，G6805-Ⅱ型電針治療儀(上海醫用電子儀器廠)。MIQAS醫學圖像定量分析系統、醫學圖像定量分析軟件、BH2生物顯微鏡(日本OLYMPUS)、4500數碼相機(NIKON)、HISTOSTAT-820切片機(RMC)，電子天平、漩渦混合器、高速離心機、超生勻漿機、超低溫冰箱由岳陽醫院中心實驗室提供。

1.2方法

1.2.1制備PD模型小鼠C57BL/6J小鼠隨機分為6組，每組14只，即正常組、模型組、中藥組、西藥組、中藥結合針刺組。小鼠適應環境10 d后開始給藥，其中模型組、西藥組、中藥組和在針藥結合療法組用生理鹽水溶解MPTP后，30 mg/kg小鼠皮下注射，每日1次，連續7 d注射，制備PD小鼠模型；正常組皮下注射等量生理鹽水，每日1次，連續7 d注射。

1.2.2治療每組隨機分為7 d組和14 d組(n=7)，每天09：00皮下注射MPTP，14：00治療。7 d組和14 d組分別治療7 d和14 d，分別于第8天和第15天上午處死取材。正常組：灌胃生理鹽水0.1 mL/10 g；模型組：灌胃生理鹽水0.1 mL/10 g。西藥組：每天灌胃美多巴0.1 mL/10 g。中藥組：中藥胃管灌注PD方0.1 mL/10 g。中藥PD方：羚羊角粉、山萸肉、鉤藤、天麻、枸杞子、丹參等。針刺組：針刺穴取百會、運動前區(雙側)，啞門。針刺方法：毫針針刺后接G6805-2型電針儀，疏密波：疏波2 Hz，密波10 Hz ，電流強度1 mA電針刺激15 min，每日1次。針刺結合中藥組：針刺穴取百會、運動前區(雙側)，針刺方法：毫針針刺后接G6805-2型電針儀，疏密波：疏波 2 Hz，密波10 Hz，電流強度1 mA，刺激15 min，每日1次。中藥應用同中藥組。7 d組針刺共7次，14 d組針刺共14次。

1.2.3自主活動計數檢測參照Kawai等[5]測試方法，自制30 cm×30 cm×15 cm有機玻璃盒，底部刻出6 cm×6 cm的格子，在安靜、光線較暗的環境中測試；小鼠適應環境10 min后，計算5 min內移動的格子數，連續測5次取平均值。分別在造模前1 d、造模后1 d、處死前1 d進行檢測。

1.2.4樣本采集與組織包埋切片各組小鼠于末次注射藥物后次日斷頭，冰上剝腦，取左側紋狀體浸入含2.5%戊二醛固定液的安瓿中，固定 1 h；進行脫水；機器平板包埋，1 h～2 h后用MEDIS WEBER13/30RR型石蠟切片機切取(3～4)μm厚冠狀平面的腦片。

1.2.5免疫組織化學(IHC)技術采用免疫組織化學二步染色法檢測。

用MIQAS醫學圖像定量分析系統對腦片進行分析，測出陽性面積及光密度值(Optical Density)。通過OLYMPUS BH2生物顯微鏡25倍物鏡下(10倍目鏡)，全視場(351000像素點)測量，選用NIKON 4500數碼相機對每張腦片攝片，每張選取3個視野，取平均值。計算出IHC指數。

2結果

2.1小鼠自主活動計數6組小鼠造模前自主活動計數無統計學意義(P>0.05)。正常組小鼠造模前、造模后、治療后自主活動計數無統計學意義(P>0.05)；模型組小鼠造模后、治療后自主活動計數顯著低于造模前(P<0.01)，造模后、治療后自主活動計數差異無統計學意義(P>0.05)；中、西藥組小鼠造模后、治療后自主活動計數顯著低于造模前(P<0.01)，治療后自主活動計數顯著高于造模后(P<0.05)；針刺、針藥組小鼠造模后、治療后自主活動計數顯著低于造模前(P<0.01)，治療后自主活動計數顯著高于造模后(P<0.05)。詳見表1。

格/5rain

2.2針藥結合療法對帕金森病模型小鼠紋狀體區多巴胺D1、D2受體活性的影響正常組小鼠紋狀體區可見大量中等大小、呈圓形或橢圓形的免疫反應陽性神經元。模型組小鼠紋狀體區的免疫反應陽性神經元數目明顯減少(P<0.05)，治療組紋狀體區免疫反應陽性神經元數目均高于模型組，其中針藥組及西藥組有統計學意義(P<0.05)。

表2　干預 7 d后針藥結合療法對PD小鼠

表3　干預 14 d針藥結合療法對PD小鼠

3討論

本實驗運用針刺、中藥、針藥結合、西藥分組治療PD模型小鼠，觀察其腦內多巴胺D1、D2受體活性變化。結果表明，MPTP造模后模型組、中藥組、西藥組、針刺、針藥組小鼠出現了震顫、肢體強直、運動遲緩、步態不穩等癥狀，自主活動計數明顯下降；經干預治療后上述癥狀有所改善，自主活動計數有所上升，但低于正常狀態。運用針刺與中藥聯合治療PD模型小鼠比單用針刺，或單用中藥治療效果顯著(P<0.05)，而單用針刺或單用中藥治療PD模型小鼠，效果并不顯著(P>0.05)。西藥治療PD模型小鼠在各組數據比較中，仍具顯著優勢(P<0.05)。由于本實驗時限限制，僅進行了7 d與14 d的數據比較，無統計學意義(P>0.05)。

帕金森病最主要的病理特征是含色素的神經元變性、缺失，尤以黑質致密部DA能神經元為主。多巴胺是一種抑制性神經介質，在黑質內合成的DA通過黑質紋狀體束到達紋狀體而發揮作用。當多巴胺能神經元減少60%～80%時，DA含量降至正常的30%，就會有PD的癥狀出現。在MPTP致PD的發病機制中涉及多種因素，其中多巴胺含量減少為MPTP致黑紋狀體通路多巴胺能神經元死亡的根本原因。

隨著人類社會的逐步老齡化，PD的發病率逐年增加，目前現代醫學藥物治療只會使癥狀減輕，而不能有效延緩疾病進程。國內外開展的手術等治療PD的方法仍處于探索階段。中醫藥治療PD在減輕疾病癥狀、延緩疾病的進程、避免現代醫學藥物長期治療后的不良反應方面可能起到重要作用。

近年來，在中醫藥治療PD機制方面進行的大量研究和探討，發現中醫藥通過保護黑質細胞、提高神經遞質含量、抑制氧化應激反應、低興奮性毒性作用等作用機制，可以顯著改善PD。運用中藥制劑對DA活性影響的研究也是主要熱點。蔡定芳[5]研究表明，養肝熄風方能夠調節多巴胺合成的限速酶酪氨酸羥化酶；王亞麗等[6]觀察到活血止顫口服液能提高鼠腦內DA含量；鮑遠程等[7]認為抗震止痙膠囊能提高紋狀體DA含量及VA/HVA比值，其機制可能在于減輕自由基損害，減少DA分解代謝。陳建宗等[8]發現枸杞子、肉蓯蓉、何首烏等組成的培補肝腎中藥可以提高 PD大鼠腦部紋狀體DA、3，4-二羥基苯乙酸(DOPAC)、NE、5-HT等含量，且對黑質、藍斑、中縫背核等神經核團有一定保護作用。

針灸作為現代替代醫學中的重要力量，已得到了世界多數國家的認可及合法的醫療地位。針灸在治療PD中療效也已得到肯定，其療效主要體現在改善癥狀、延緩病程、減少西藥用量及其副反應等方面，這種治療方法被越來越多的患者所接受。動物實驗表明，針刺能明顯減輕PD模型大鼠中腦黑質多巴胺能神經元的凋亡[9]，改善大鼠行為學，提高紋狀體DA及其代謝產物的含量。王玲玲等[10]觀察針灸對 PD 患者腦干誘發電位Ⅴ波潛伏期、Ⅲ-Ⅴ峰間期和Ⅰ-Ⅴ峰間期三項指標的影響，結果針灸組Ⅴ波潛伏期、Ⅲ-Ⅴ峰間期及Ⅰ-Ⅴ峰間期均見明顯縮短，這種縮短與 Webster量表的減少呈現明顯的相關關系，針灸可能提高了腦內DA的含量及腦內 DA能神經元的興奮性，獲得了臨床療效。羅明富等[11]用免疫熒光法觀察電針陽陵泉和舞蹈震顫區對 PD大鼠中腦黑質和腎上腺髓質酪氨酸羥化酶 (TH )的影響，發現病側電針組的熒光反應強于對照組，提示電針可能增強了TH的活性。針刺可以調節腦內中樞通路的神經遞質含量，針刺后DA含量增加，針刺能夠通過刺激神經通路，促使神經遞質DA的分泌合成，使PD的癥狀得以緩解。

本實驗中應用針藥結合干預治療PD模型小鼠，觀察其腦內多巴胺D1、D2受體活性，顯示針藥連用治療顯著優于單用針刺或單用中藥治療，為今后臨床帕金森患者提供了一種新的治療參考模式。

參考文獻：

[1]梁天佳.帕金森病發病機制研究進展[J].醫學綜述，2008，14(7)：1040-1042.

[2]孫斌.帕金森病的藥物治療現狀[J].中國綜合臨床，1999，15(4)：295.

[3]Walkinshaw G，Waters CM.Induction of apoptosis in cate-cholaminergic PC12cells by L-DOPA implications for the treatment of Parkinson’s disease[J].J Clin Invest，1995，95(6)：2458-2464.

[4]Offen D，Ziv L，Gorodin S，et al.Dopamine induced programmed cell death in mouse thymocytes[J].Biochim Biolphys Acta，1995，1268(2)：171-177.

[5]蔡定芳，陳錫群，高穎，等.補腎養肝方藥對長期服用左旋多巴帕金森病大鼠黑質紋狀體功能的影響[J].中國中西醫結合雜志 ，2002，22(1)：43-46.

[6]王亞麗.顫證病理機制及治療的實驗研究[J].陜西中醫學院學報，1999，22(6)：45-46.

[7]鮑遠程，朱紅艷.抗震止痙膠囊對帕金森大鼠氨基酸類神經遞質含量的影響[J].中國醫師雜志，2004，增刊：68-70.

[8]陳建宗 ，李剛 ，謝永宏 ，等.培補肝腎中藥對 PD小鼠模型紋狀體某些單胺類遞質的影響[J].成都中醫藥大學學報，2002，(25)4 ：34.

[9]王倩，陳興華，唐純志，等.針刺對帕金森模型大鼠紋狀體多巴胺及代謝產物含量影響的實驗研究[J].新中醫，2006，38(6)：92-93.

[10]王玲玲 ，何崇 ，劉躍光 ，等.針刺對 PD 患者腦干誘發電位的影響[J].南京中醫藥大學學報(自然科學版)，2000，16(4)：229.

[11]羅明富，王志英，王平.電針對震顫麻痹大鼠腦部和腎上腺髓質酪氨酸羥化酶的影響[J].針刺研究，1997，22(4)：292.

(本文編輯王雅潔)