桃紅四物湯對兔皮片移植模型血管生成素影響的研究

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·中藥藥理·

桃紅四物湯對兔皮片移植模型血管生成素影響的研究

黃承宇1，孫紹裘2*，李益亮2

（1.湖南中醫藥大學,湖南長沙410208;2.湖南中醫藥大學第二附屬醫院,湖南長沙410005）

〔摘要〕目的通過檢測兔皮片移植后桃紅四物湯對血管生成素（angiogenin,Ang）血清含量及皮片吻合區基因表達情況的影響，探討桃紅四物湯對皮片移植中促進血管新生的作用機制。方法將75只實驗兔按隨機數字表法將其分為五組，即桃紅四物湯低、中、高劑量組、模型組和假手術組，每組15只。造模后分組干預，并于術后2、5、8d三個時限，從每組隨機抽取5只實驗兔，心臟采血后予以耳緣靜脈注射空氣處死，并切取移植皮片吻合區皮片組織。通過ELISA和RT-PCR檢測血清樣品中Ang的含量及皮片吻合區基因表達情況。結果桃紅四物湯三組中移植皮片的新生血管密度明顯高于模型組及假手術組（P＜0.05），差異有統計學意義。Ang血清含量及基因表達中桃紅四物湯三組表達量高于模型組及假手術組（P＜0.05），差異有統計學意義。結論桃紅四物湯能上調組織中血管新生促進因子Ang的表達，促進移植皮片成活。

〔關鍵詞〕桃紅四物湯;皮片移植;血管生成素;血管新生

Effects of Taohongsiwu Decoction on Angiogenin of Rabbit Skin Graft Models

HUANG Chengyu1, SUN Shaoqiu2*, LI Yiliang2

(1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China; 2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410005, China)

〔Abstract〕Objective To investigate the mechanism of Taohongsiwu Decoction on promoting angiogenesis skin grafby detectingserum angiogenin (Ang) concentration and gene expression. Methods 75rabbits were randomly divided into 5groups, namely, low dose Taohongsiwu Decoction group, middle dose Taohongsiwu Decoction group, high dose Taohongsiwu Decoction group, model group and sham operation group, 15rats in each group. After grouping intervention, at the three time-points: 2d, 5d, 8d, 5rabbits were randomly selected from each group.After blood collection, the rats were executed by air injection of the ear vein, and the skin grafts anastomosed area skin tissues were cut. The Ang content in serum samples and gene expression in anastomosed area were detected by ELISA and RT -PCR. Results The microvessel density of skin grafts in Taohongsiwu Decoction groups was significantly better than the model group and operation group (P<0.05), the difference was statistically significant. Ang content in serum samples and gene expression in the Taohongsiwu Decoction groups were higher than that of the model group and operation group(P<0.05), the difference was statistically significant. Conclusion Taohongsiwu Decoction can upregulate Ang expression in the tissues to promote the survival of skin graft.

〔Keywords〕Taohongsiwu Decoction; skin graft; angiogenin; angiogenesis

皮膚是人體的主要器官之一，覆蓋著整個身體表面，不僅具有感覺、調節體溫以及分泌排泄等功能，而且還能阻止病菌或其他有害物體的入侵，防止體液、電解質和蛋白質等損失，保護生命和維持機體與環境相適應。一旦皮膚發生缺損而不能及時獲得修復，就會失去正常外形與功能活動，甚至危及生命。而皮片移植是目前臨床治療皮膚缺損最常用的方法之一，雖然它能簡單快速有效封閉傷口和創面，修復體表完整，恢復肢體功能，但是術后容易出現皮片的部分壞死或全部壞死并最終導致手術失敗。目前學者普遍認為術后早期重建移植皮片血運促血管新生是皮片成活的關鍵。本研究以兔皮片移植模型為研究對象，采用桃紅四物湯干預后，檢測不同劑量桃紅四物湯對血管生成素（angiogenin, Ang）的表達情況，初步揭示其促進移植皮片成活及血管新生的作用機制，為臨床上中醫藥治療皮膚缺損提供新思路和實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康新西蘭大白兔120只，10～12月齡，雌雄各半，體質量（2.3±0.2）kg。許可證號：SYXK(湘)2013-2005。由湖南中醫藥大學動物實驗中心統一購買，并由動物實驗中心提供飼料進行統一喂養。

標準系統效應原理是指標準系統的效應并不是來自單個標準效應的簡單疊加，而是來自組成該系統的相互協同的標準集合效應，且這個整體效應超過標準單個效應的總和。[2]

1.1.2藥物桃紅四物湯：參考吳謙《醫宗金鑒》桃紅四物湯的配比：生地黃20g，當歸20g，赤芍20g，川芎10g，桃仁20g，紅花10g。飲片購自湖南中醫藥大學第二附屬醫院藥劑科，由煎藥房代煎，制成含生藥2g/mL的湯劑，并封包冷藏。

1.1.3主要試劑及儀器PCR引物設計由上海生工生物工程有限公司完成；GoTap qPCR Master Mix購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司；Real-Time7500型定量PCR擴增儀（美國應用生物系統公司）；ebioscience（dll4）ELISA試劑盒購自萊茲生物科技有限公司;辣根過氧化物酶標記抗體購自Proteintech公司；TRIZOL試劑盒購自Invitrogen公司；LKB-Ⅲ型AO切片機(瑞典LKB公司生產)；BX5O型光學顯微鏡(OLYMPUS公司)；ipp6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics公司)。

1.2方法

1.2.1分組與造模[1]將75只實驗兔，適應性喂養1周后稱質量，按質量分層進行編號，按隨機數字表法分為五組，即桃紅四物湯低、中、高劑量組、模型組、假手術組，每組15只。造模：實驗前6h禁食水，麻醉完成后，兔臺常規鋪無菌巾單。將實驗兔固定在兔臺上，碘酒常規消毒手術區域后，手術剝離兔背脊柱棘突右側1cm處，從第三胸椎棘突起向兔尾長6cm，寬3cm，厚度約為0.5mm大小近長方形皮片，再于其腹部用手術刀取同樣大小厚度皮片，清理皮下脂肪組織，修整后移植于背部皮膚缺損區，間斷縫合固定于背部，并采用加壓打包法包扎傷口，腹部切口則直接拉攏縫合。桃紅四物湯低、中、高劑量組、模型組都按上述方法造模，假手術組只在背部及腹部的相應區域用手術刀做同等面積、同等大小的切口，切開皮膚，深達皮下組織，但不進行皮下組織分離，間斷縫合手術切口。

1.2.2干預方法根據人與動物體表面積換算公式[2]，各組實驗兔灌藥劑量為：桃紅四物湯低、中、高劑量分別為：2.5、5、10g/kg,同時模型組和假手術組給予等體積的蒸餾水灌胃。于術后第2、5、8天3個時限，從每組隨機抽取5只實驗兔，行心臟采血后，處死并切取移植皮片吻合區皮片組織，按常規方法制成超薄切片，病理組織電鏡下觀察，并檢測血清及皮片組織中Ang的含量及基因表達情況。

1.3觀察指標及檢測方法

1.3.1組織病理學變化及血管密度檢測切取移植皮片吻合區皮片，以4%多聚甲醛溶液固定24h，石蠟包埋切片，然后使用平推式切片機連續切片，切片載入載玻片后予行蘇木素-伊紅（HE染色）染色，染色時間為10min左右，切片厚度約5um。光學顯微鏡下于真皮及皮下肉芽組織處隨機選取3個視野，觀察毛細血管橫斷面數量，并求其平均值。

1.3.3ELISA檢測血清中Ang含量取備用血清用ELISA法測定，按照試劑盒說明書操作。包被：用稀釋液（PH 9.60.05M碳酸鹽）稀釋血清至蛋白含量1～10μg/mL，每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1mL（同時設置空白孔、陰性對照孔）,放置于4℃環境過夜。洗滌：棄孔內溶液后，用洗滌緩沖液（PH 7.4PBS 0.15M）沖洗3次，每次3min。加樣：加稀釋的待檢樣品0.1mL至反應孔中，放于37℃環境1h，然后同上洗滌。加酶抗體：加新鮮酶標抗體0.1mL至反應孔中，放于37℃環境1h，然后同上洗滌。加底物液（現用現配）：加底物液TMB0.1mL于反應孔中，放于37℃環境20min。終止反應：加2M硫酸0.05mL，終止反應。結果判斷：空白孔調零，測定標本的吸收值/一組陰性標本測定的平均值（P/N）表示，當P/N＞2時作為抗體的效價。

1.4統計學方法

數據均采用SPSS 18.0統計軟件進行處理，計量資料用“±s”表示，采用單因素方差分析，若滿足正態性分布和方差齊性檢驗（P>0.05），用LSD檢驗，P<0.05，有統計學意義；若滿足正態性分布，不滿足方差齊性，則用Dunnett’s T3檢驗，P<0.05，有統計學意義。

2　結果

2.1各組血管密度檢測結果

桃紅四物湯三組術后2、5、8d兩兩比較，差異均有統計學意義（F=76.72，P<0.05）；模型組和假手術組術后2、5、8d兩兩比較，差異均有統計學意義（F=58.34，P<0.05）。提示桃紅四物湯低、高、中劑量組、模型組及假手術組術后2、5、8d移植皮片的血管密度是逐漸增高，均有血管新生。術后2、5、8d比較，桃紅四物湯低、中、高劑量組與模型組及假手術組比較均有統計學意義（F=63.48，P<0.05），桃紅四物湯低劑量組與中、高劑量組比較有統計學意義（P<0.05），桃紅四物湯中劑量組與高劑量組比較無統計學意義（P>0.05）。結果見表1和圖1。

表1　各組血管密度檢測結果　(±s，n=15，個）

表1　各組血管密度檢測結果　(±s，n=15，個）

注：與假手術組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05；低劑量組和中劑量組、高劑量組比較△P<0.05；與術后2d比較▲★P<0.05；與術后5d比較★P<0.05。

組別假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組給藥劑量（g/kg）術后2d 5.37±0.362.55±0.41* 2.83±0.24*#△3.31±0.26*#3.53±0.67*#術后5d 5.62±0.56▲4.25±0.68*▲4.80±0.74*#△▲5.88±0.42*#▲5.92±0.48*#▲術后8d 6.18±0.33★5.86±0.66*★6.03±0.40*#△★6.27±0.53*#★6.27±0.59*#★--2.5510

圖1　各組移植血管顯微光鏡圖（HE×400）

2.2各組血清Ang含量和皮片吻合區中Ang基因表達

各組血清Ang的含量及皮片吻合區中Ang的基因含量均是術后2d到5d逐漸升高，然后術后5d到8d逐漸下降的趨勢。在2、5、8d內，桃紅四物湯低、中、高劑量組術后血清Ang的含量及皮片吻合區中Ang的基因含量均高于模型組及假手術組（P<0.05）；桃紅四物湯中、高劑量組術后血清Ang的含量及皮片吻合區中Ang的基因含量高于桃紅四物湯低劑量手術組（P<0.01）；桃紅四物湯中劑量組與桃紅四物湯高劑量組術后血清Ang的含量及皮片吻合區中Ang的基因含量無差別（P>0.05）；模型組與假手術組術后血清Ang的含量及皮片吻合區中Ang的基因含量差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表2-3和圖3。

表2　各組血清Ang的含量結果比較　(±s，n=15,ng/L）

表2　各組血清Ang的含量結果比較　(±s，n=15,ng/L）

注：與假手術組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05；低劑量組和中劑量組、高劑量組比較△△P<0.01。

術后8d組　別　給藥劑量（g/kg）術后2d 術后5d 192.27±4.09181.99±8.04* 201.00±6.29*#△△211.80±5.18*#209.62±6.67*#假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組--2.5510196.67±4.45190.96±4.17* 199.79±3.63*#△△211.34±4.02*#208.75±2.89*#229.02±6.52213.36±6.41* 244.20±5.56*#△△290.18±5.97*#288.10±6.31*#

3　討論

Ang是促血管新生因子之一，它最早是在人類的結腸癌細胞系HT-29細胞培養上清中被發現,由123個氨基酸殘基組成，是一種分泌性單鏈堿性蛋白質。它可以促進血管內皮細胞的增殖，參與胚胎發育和創傷愈合等過程中血管的新生與重建。有研究表明[3]，Ang能調控許多與血管新生相關的分子蛋白，是血管新生的重要樞紐。它能促進內皮細胞形成管腔樣結構，增強內皮細胞與管周細胞的相互作用，促進血管發育成熟和保持其完整性[4]。而有研究發現，皮片移植后血管的重建一般需要經歷兩個過程[5]：在皮片移植后最初48h內是血漿營養期，主要是使移植皮片產生內源性固定；在皮片移植48h后是血管新生與血液循環的建立期，血管芽在皮片與受區組織間活躍生長，形成管腔，一般術后4-5天內完成。

表3　各組皮片吻合區Ang的mRNA含量結果比較(±s，n=15,ng/L）

表3　各組皮片吻合區Ang的mRNA含量結果比較(±s，n=15,ng/L）

注：與假手術組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05；低劑量組和中劑量組、高劑量組比較△△P<0.01。

組別假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組給藥劑量（g/kg）--2.5510術后2d 0.13±0.010.09±0.00* 0.19±0.01*#△△0.23±0.01*#0.25±0.02*#術后5d 0.18±0.010.13±0.01* 0.28±0.00*#△△0.37±0.02*#0.36±0.01*#術后8d 0.12±0.010.08±0.00* 0.14±0.01*#△△0.18±0.00*#0.18±0.01*#

圖2　各組皮片吻合區Ang的mRNA含量結果表達電泳圖

皮膚缺損所造成的創面相當于中醫學中的“潰瘍”、“金瘍”。中醫理論認為各種外傷，如跌打損傷、車禍致傷、金刃所傷等，均可致使經脈受損，氣機阻滯，從而導致血行不暢或脈管破損而出血，成為離經之瘀血，“血瘀必兼氣滯”，氣滯又加重血瘀。《正體類要》指出：“肢體傷于外，則氣血傷于內，營衛有所不貫，臟腑由之不和”，因此中醫中藥治療外傷，多重氣血，氣滯血瘀是外傷的病機核心，活血化瘀生新是其重要的治療原則，所以皮片移植術后，證屬氣滯血瘀，應予以活血化瘀治療。桃紅四物湯是活血化瘀的經典方，具有補血而不滯血，和血不傷血特點[6]。有研究發現[7]，桃紅四物湯能改善兔激素性股骨頭缺血性壞死模型中股骨頭局部血運，促進局部微血管的新生，增加微血管密度，從而達到修復壞死股骨頭目的。劉旺華[8]等證實桃紅四物湯能增加隨意皮瓣的成活面積，增加皮瓣毛細血管密度。本實驗也通過研究發現，桃紅四物湯低、中、高組與模型組比較，血管密度明顯增高，血清中Ang的濃度及皮片中基因的表達量也增高，可以得知桃紅四物湯能促進血管新生，初步揭示了皮片移植術后早期血管新生促進因子Ang含量可以促進血管新生的機制。

移植皮片成活的關鍵主要決定于皮片與受皮組織間是否建立了有效的血液循環，現代研究發現[9]早期重建移植皮片血運促進血管新生是皮片成活的關鍵。血管新生是指在原有的血管基礎上通過血管內皮細胞游走、增殖、血管分裂及分支，形成基底膜而構造成新的血管網的過程。這個過程是由許多促進與抑制因子控制而保持平衡，一旦此平衡被破壞，就會激活血管系統生成新生血管或抑制血管系統使血管硬化[10]。Ang并不能直接促進血管內皮細胞增殖，而是誘導血管內皮細胞出芽形成新的血管網結構，并保持血管網結構的完整和穩定。通過本實驗結果可以得知，血管新生促進因子Ang的含量在皮片移植術后是隨著時間的延長逐步增高的，在術后第5d達到一個高值，到術后第8d就出現明顯下降的趨勢。而血管密度是隨著術后時間的延長一直增高，術后第2d到術后第5d明顯增高，術后第5d到術后第8d稍有增高。這也證明了皮片移植術后早期Ang含量的增高可以促進血管新生，增高血管密度，促進移植皮片成活。本實驗通過對桃紅四物湯干預后兔皮片移植模型血管新生促進因子Ang影響的研究，初步揭示了桃紅四物湯促血管新生機制，證實了桃紅四物湯能夠促進皮片移植成活，然而桃紅四物湯對皮片移植成活的影響是多方面，其作用機制還有待進一步研究。

參考文獻:

[1]付萬進,王暉,龐玉新,等.皮膚創傷模型研究進展[J].廣東藥學院學報,2013,2:214-218.

[2]賀石林,王鍵,王凈凈.中醫科研設計與統計學[M].長沙：湖南科學技術出版社,2008:48.

[3]Kishimoto K,Liu S,Tsuji T.Endogenous angiogenin in endothelial cells is a general requirement for cell proliferation and angiogenesis[J].Oncogene,2005,24(3):445.

[4]朱邵品,許迅.血管生成素與炎癥及新生血管關系的研究進展[J].江蘇醫藥,2013,4:452-454.

[5]李倩,胡明玉,章宏偉,等.負壓創面治療技術對皮膚移植成活的臨床觀察及實驗研究[J].現代生物醫學進展,2011,11(17):3284-3289.

[6]丁艷杰,張前德.桃紅四物湯臨床與實驗研究進展[J].江蘇中醫藥, 2010,42(1):77-79.

[7]齊振熙,杜傳寶.桃紅四物湯對激素性股骨頭缺血壞死局部微血管密度的影響[J].中國中醫骨傷科雜志,2008,16(4):31-33.

[8]劉旺華,曾飛,趙海霞.桃紅四物湯對大鼠背部隨意皮瓣存活的影響[J].云南中醫中藥雜志,2012,1:57-58.

[9]劉嘉鋒,鐘文惠,張一鳴,等.重組人VEGF基因在游離組織移植中作用的實驗研究[J].中國美容醫學,2008,17(4):540-543.

[10]Szekanecz, Besenyei T, Paragh G, et al. New insights in synovial angiogensis[J]. Joint Bone Spine,2010,77(1):13-19.

（本文編輯楊瑛）

〔通訊作者〕*孫紹裘，男，主任醫師，E-mail：54sunshaoqiu@163.com。

〔作者簡介〕黃承宇，男，碩士，主要從事中醫骨傷實驗與臨床研究。

〔基金項目〕國家自然科學基金資助項目（項目編號：81373658）。

〔收稿日期〕2015-05-28

〔中圖分類號〕R285.5；R751

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.11.002