養陰潤目丸對干眼模型大鼠結膜上皮細胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK表達的影響

?

養陰潤目丸對干眼模型大鼠結膜上皮細胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK表達的影響

李點1，王超群2，廖亮英1，胡平2，彭銀艷2

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007；2.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208）

〔摘要〕目的研究養陰潤目丸對干眼模型大鼠結膜上皮細胞中細胞間粘附分子-1（ICAM-1）、絲裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）、磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶p38（p-p38MAPK）表達的影響。方法將60只SD雄性大鼠隨機分為5組（正常組、假手術組、養陰潤目丸組、新淚然組、模型組），每組12只。除正常組與假手術組外均采用去勢法制造干眼模型。造模成功后一周開始分別給藥治療。用藥3個月后，分別進行淚液分泌試驗（SIT）及淚膜破裂時間（BUT）的檢測，取大鼠結膜上皮細胞，采用免疫組化法檢測p38MAPK的表達，采用Western blot法檢測ICAM-1、p-p38MAPK的表達。結果與模型組比較，養陰潤目丸組SIT明顯增多，BUT明顯延長；養陰潤目丸可顯著減少結膜上皮細胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK的表達，差異有統計學意義（P<0.01）。結論養陰潤目丸可有效改善眼表癥狀，增加淚液分泌量，延長淚膜破裂時間，下調結膜上皮細胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK的表達。提示干眼的發病機制與炎癥及p38MAPK信號通路相關，養陰潤目丸對干眼的治療具有一定的應用前景。

〔關鍵詞〕干眼；養陰潤目丸；結膜上皮細胞；ICAM-1；p38MAPK；p-p38MAPK

Effects of Yangyin Runmu Pills on the Expression of ICAM-1, p38MAPK and p-p38MAPK in Conjunctival Epithelial Cells of Dry Eye Model Rats

LI Dian1, WANG Chaoqun2, LIAO Liangying1, HU Ping2, PENG Yinyan2

(1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410007, China; 2. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China)

〔Abstract〕Objective To study the effect of Yangyin Runmu Pills on the expression of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1), p38mitogen-activated Protein kinase (p38MAPK), phospho-and mitogen activated protein kinase p38antibody (pp38MAPK) in conjunctival epithelial cells of dry eye model rats. Methods Sixty Sprague -Dawley (SD) male rats were randomly divided into five groups (the normal group, sham operation group, Yangyin Runmu Pills group, Xinleiran group, model group), and 12rats in each group. All groups except for the normal group and sham operation group were prepared as the dry eye models by using the method of ovariectomy. After one week, the rats were treated with medicines. After three months treatment, schirmer tear test (STT) and tear film breakup time (BUT) of rats were detected. Theconjunctival epithelialcells were taken to test the expressive activities of p38MAPK by immunohistochemical methodand ICAM-1and p-p38MAPK by Western blot. Results Compared with the model group, SIT of Yangyin Runmu Pills group was increased obviously, BUT was extended obviously and the expressions of ICAM-1, p38MAPK, p-p38MAPK in conjunctival epithelial cellswere decreased evidently, the differenceswere statistically significant (P<0.01). Conclusion Yangyin Runmu Pills can improve the symptoms of ocular surface, increase the tear secretion,prolong appears broken, and down -regulatethe expression of ICAM-1, p38MAPK, p-p38MAPK in conjunctival epithelial cells, which suggests that the pathogenesis of dry eye is related with inflammation and p38MAPK signaling pathway, and Yangyin Runmu Pills have potential application fortreating dry eye.

〔Keywords〕dry eye；Yangyin Runmu Pills；conjunctival epithelial cell；ICAM-1；p38MAPK；p-p38MAPK

干眼，中醫稱為“白澀癥”，又名“干澀昏花癥”及“神水將枯癥”,是目前最常見的眼科疾病之一。相關研究顯示[1-2]在中國干眼發病率為17.0%，中國北部和西部地區的年齡超過60歲的女性群體干眼發病率高達31.3%和34.4%，而在東南地區發病率約為9.54%，且女性明顯高于男性。因此探索干眼發病機制及治療方法正逐漸成為當前的研究熱點。已有研究證明[3-6]，炎癥在干眼的發病機制中具有重要作用，且與MAPK信號通路激活相關。本課題組前期研究表明[7]，用經驗方養陰潤目丸（原名“滋陰潤目丸”）治療干眼，在改善患者主觀癥狀及增加淚液分泌等方面具有較好的療效，但其具體作用機制不明。因此本研究擬通過復制大鼠干眼模型，探究養陰潤目丸對干眼模型大鼠結膜上皮細胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK表達的影響，為該方的臨床應用提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康，無眼部疾患，1月齡SD雄性大鼠60只，體質量120～150g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK(湘)2011－0003。淚液分泌試驗(schirmer I test,SIT) ≥10mm/5min和淚膜破裂時間(break-up time, BUT)≥10s的動物方可使用。每4只1籠，常規飼料喂養，控制室溫25℃左右，濕度55%左右。

1.1.2主要藥物養陰潤目丸（湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供）方藥組成：生地黃，當歸，枸杞子，沙參，白芍等。新淚然滴眼液（Alcon Laboratories，Inc；批號:219429F）主要含右旋糖酐、羥丙甲纖維素，甘油等。

1.1.3主要試劑p38（武漢博士德，BA1325－2）；ICAM（武漢博士德，A2189）；β-actin（Epitmics，1854-1）；羊抗鼠HRP標記二抗（碧云天，A0216）；RIPA組織細胞快速裂解液（上海基爾頓生物，BYL40825）；BCA蛋白定量試劑盒（thermo，PICPI23223）；蛋白預染Marker（Fermentas，SM1811）；NC膜（Millipore，HATF00010）；即用型SABC免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋，SA1022）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋，AR1022）。

1.1.4主要儀器研究型正置顯微鏡（麥克奧迪實業集團公司）；淚液檢測濾紙條（天津晶明新技術開發有限公司，批號：20120707）；mini protean 3cell電泳儀型號（BIO－RAD公司)；HI1210型號水浴鍋（Leica公司,）；暗匣（粵華醫療器械）。

1.2方法

1.2.1分組及造模SD大鼠60只（120眼），采用隨機數字法分為5組（正常組A、假手術組B、養陰潤目丸組C、新淚然組D、模型組E），每組12只（24眼）。參照實驗動物模型的制作[8-10]，將C，D，E組大鼠切除睪丸及附睪，B組只切開陰囊而不切除睪丸及附睪，A組不做任何處理。

1.2.2給藥方法造模后1周，待傷口基本愈合開始給藥。C組采用生理鹽水滴眼，滴雙眼，1滴/次，3次/d，養陰潤目丸與生理鹽水按9g/100mL比例配置灌胃，1mL/100g，1次/d；D組采用新淚然滴眼液滴眼，滴雙眼，1滴/次，3次/d，并用生理鹽水灌胃，1mL/100g，1次/天；A、B、E組三組用生理鹽水分別灌胃與滴眼，用量及頻次同C、D組，連續給藥3個月。（根據等效劑量換算公式D2=D1×R2/R1，按60kg成人每天藥量9g，大鼠140g體質量為標準，《常用實驗動物與人的體表面積比值表》查表得R1=346.68，R2=5.55，得實驗大鼠給藥劑量D2=9× 5.55÷346.68=0.14g，按大鼠1mL/100g灌胃，養陰潤目丸與生理鹽水按9g/100mL比例配置）。

1.2.3SIT試驗及BUT測定根據預實驗結果顯示大鼠正常淚液分泌量比正常人少，以5mm×35mm大小濾紙條檢測，長度僅能達到被折彎的5mm左右，為了減少實驗誤差，參照文獻[11]，將其剪成兩半，即2.5mm×35mm大小，一端折彎5mm，置于大鼠下瞼內1/3結膜囊處，5min后測量濾紙條浸濕長度（不包括反折部分）。BUT測定：用玻璃棒蘸取1%熒光素鈉滴于大鼠下眼瞼結膜囊內，人工瞬目后于裂隙燈下用鈷藍光掃描照射，記錄角膜第一個黑斑出現的時間。

1.2.4標本取材治療3個月后，將3mm×3mm大小的乙酸纖維素薄膜紙條一角，輕輕置于大鼠顳側球結膜表面，用玻璃棒輕壓3～5min后取出，貼于5mm×5mm大小防脫氨基載玻片上，重復取標本2次，待薄膜稍干后，置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.2.5免疫組織化學染色檢測p38MAPK①涂片用蒸餾水洗2min×2次；②3%H2O2去離子水孵育10min，以阻斷內源性過氧化物酶；③蒸餾水洗2min×2次；④PBS（PH 7.2～7.6）洗2min×3次；⑤滴加一抗p-p38MAPK（1∶100稀釋）后37℃孵育2小時，PBS（PH 7.2-7.6）洗2min×3次；⑥滴加相應生物素化二抗，37℃孵育20min，PBS（PH 7.2-7.6）洗2min×3次；⑦滴加試劑SABC，37℃孵育30min，PBS（PH 7.2～7.6）洗2min×3次；⑧DAB顯色：室溫條件下顯色，鏡下控制反應時間，自來水充分沖洗；⑨蘇木素復染，中性樹膠封片。

1.2.6細胞計數方法高倍鏡下每個涂片至少觀察5個視野以上，計數格內細胞總數，以細胞膜和細胞漿有明顯的棕黃色或棕褐色為陽性，計算陽性細胞比率。

1.2.7Western檢測ICAM-1、p-p38MAPK1①樣品準備將組織剪成細小的碎片，按每20mg組織加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑），勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃12000r/min離心15min，取上清，進行蛋白質定量后貯存于-80℃冰箱；②蛋白定量；③PAGE膠的制備；④上樣及電泳；⑤轉膜；⑥膜上蛋白的檢測；⑦膜的封閉及抗體孵育封閉：5%脫脂奶粉（檢測磷酸化蛋白用BSA）室溫封閉1h。一抗：根據說明書P381∶150ICAM1∶200β-actin 1∶1000稀釋抗體,抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，和膜室溫孵育2h。二抗：孵育一抗的膜用TBST洗滌5min×3次。隨后根據用量，按照1∶1000稀釋HRP標記的二抗，與膜37℃孵育1h。用TBST洗滌5min×3次；⑧顯色；⑨ECL化學發光檢測。

1.3統計學方法

根據詳細的數據資料，用SPPS 17.0軟件進行統計學處理，實驗數據以“±s”表示。符合正態性和方差齊性時,則用多因素方差分析兩兩比較法；不符合正態性和方差齊性時，則用非參多重比較法。均以P＜0.05（雙側檢驗）為差異有統計學意義。

2　結果

2.1SIT、BUT的測定結果

各組大鼠治療前后SIT及BUT檢測，組內比較：A、B兩組治療前后比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；C、D、E三組用藥前后比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。組間比較：同一時間段A組與B組比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；A、B兩組分別與C、D、E三組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；治療前C、D、E三組之間分別比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；治療3月后E組與C、D兩組分別比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；C組與D組比較，差異無統計學意義（均P＞0.05）。見表1。

表1　各組大鼠治療前后SIT、BUT測量值比較　(±s）

表1　各組大鼠治療前后SIT、BUT測量值比較　(±s）

注：組間比較與A、B組分別比較，△△P＜0.01；與E組比較☆☆P＜0.01；治療前后比較◇P＜0.05。

A組B組C組D組E組組別n BUT(s)治療前　治療3月后12.48±1.01　12.25±1.0712.46±1.03　12.25±1.028.41±0.79△△9.61±0.82△△☆☆◇8.09±0.81△△9.12±0.69△△☆☆◇8.22±0.71△△6.21±0.72△△◇1212121212SIT（mm）治療前　治療3月后11.9±1.32　11.8±1.2711.7±1.37　11.6±1.368.0±1.07△△9.6±1.04△△☆☆◇7.8±1.15△△9.0±1.37△△☆☆◇8.0±0.98△△6.4±0.84△△

2.2各組大鼠結膜上皮細胞的p38MAPK表達的比較及病理形態學改變

去勢造模3個月后，A組和B組結膜上皮細胞呈扁平形，核居中，形圓，胞膜清晰，細胞膜和細胞漿內幾乎無明顯的棕黃色或棕褐色，p38MAPK蛋白表達含量極少，即無p38MAPK陽性表達。E組結膜上皮細胞的細胞膜和細胞漿中有大量棕黃色沉著，即p38MAPK大量陽性表達，其中，結膜上皮細胞部分核固縮崩解、消失，不同程度角化。C組和D組可見p38MAPK有表達，C組的結膜上皮細胞的棕黃色顆粒沉著程度較D組低，但兩組比較無統計學意義。見表2、圖1。

表2　各組大鼠結膜上皮細胞中p38MAPK陽性細胞比率　(±s）

表2　各組大鼠結膜上皮細胞中p38MAPK陽性細胞比率　(±s）

注：與A、B組分別比較△△P＜0.01；與E組比較☆☆P＜0.01。

組別np38MAPK陽性細胞A組B組C組D組E組12121212120.086±0.0420.124±0.0460.309±0.070△△☆☆0.354±0.066△△☆☆0.471±0.060△△

圖1　各組大鼠結膜上皮細胞中p38MAPK表達光鏡圖(DAB，×400)

2.3各組大鼠結膜上皮細胞中ICAM -1、p -p38MAPK表達的比較

A、B組結膜上皮細胞中ICAM-1、p-p38MAPK蛋白含量少，即無陽性表達，而C、D、E組結膜上皮細胞中ICAM-1、p-p38MAPK大量陽性表達；C、D組結膜上皮細胞中ICAM-1、p-p38MAPK蛋白含量明顯低于E組（P＜0.01）；C、D組兩組間差異不顯著（P＞0.05），見表3、圖2-3。

表3　各組大鼠結膜上皮細胞ICAM-1、p-p38MAPK蛋白表達水平　(±s）

表3　各組大鼠結膜上皮細胞ICAM-1、p-p38MAPK蛋白表達水平　(±s）

注：與A、B組分別比較，△△P＜0.01；與E組比較,☆☆P＜0.01。

組別A組B組C組D組E組n 1212121212ICAM-10.129±0.0350.161±0.0480.471±0.141△△☆☆0.504±0.206△△☆☆0.875±0.412△△p-p38MAPK 0.082±0.0350.150±0.0700.361±0.113△△☆☆0.305±0.064△△☆☆0.474±0.099△△

3　討論

干眼在中醫古籍中有不同的命名，但機理基本是一致的。《審視瑤函》將其稱為“神水將枯”、“白澀癥”等，而《證治準繩》將其歸于干澀昏花癥。《諸病源候論》曰：“目，肝之候也，臟腑之精華，崇脈之所聚，上液之道，其液竭者，則目澀。”五臟充和，化生有源，津液在目化為神水，潤澤目珠，濡養眼球。陰血虧虛，津液虧乏，則淚液生化之源不足，目失淚水濡潤而生燥，導致干眼的發生。《目經大成》認為“此臟衰火作，雖真元未必遽絕，而自致之邪妄耗膏液。”指出干眼是由肝腎虧虛，津液虧損，虛火上炎，或郁熱化火，上攻于目，灼津耗液，目失濡養所致。由此推測在干眼復雜的發病機制中，肝腎不足，津液虧虛，目失潤養是其主要病機。筆者根據多年的臨床經驗,強調干眼與臟腑功能失調關系密切。認為人身津液之化生，源于臟腑，滋養眼球，圓潤如珠，則發揮視物察色功用，臟腑功能失調，氣血不足，氣機不暢等均引起干眼，治療應注重整體觀念和辨證施治，堅持以八綱辨證和臟腑辨證合參，自擬養陰潤目丸治療干眼兼口干唇燥、頭暈眼花、腰酸腿軟、記憶力減退、舌紅苔薄少津、脈細，屬肝腎虧虛者，療效頗捷。養陰潤目丸方中以生地黃、當歸、枸杞子為君，滋補肝腎；沙參、白芍、石斛、桑椹子、黃精具有益胃生津、滋陰清熱、清心除煩、補腎益精、養肝明目之功效，與君藥配伍具有增水行舟之功，以緩解肝腎不足引起的干眼癥狀，共為臣藥，君臣共奏滋陰補腎、生津養血之功；佐以牡丹皮清熱涼血；菊花清熱解毒，平肝明目；黃芪益氣明目。本方以補為主，以清為輔，補清相合，補中有清，補中有散，滋補而不膩，清散而不過，為治療干眼癥的有效方劑。

圖2　各組大鼠結膜上皮細胞ICAM-1蛋白表達

圖3　各組大鼠結膜上皮細胞p-p38MAPK蛋白表達

已有研究表明[12-13]，干眼發病的共同機制是基于免疫的炎癥反應，眾多細胞因子的交互作用參與了干眼的發病過程。各類炎性細胞的浸潤和細胞炎性因子的釋放，可通過細胞信號轉導通路將信息傳遞至細胞核內，調控相關基因和蛋白的表達，進而對結膜細胞的生長周期、形態及功能產生影響。ICAM-1與干眼的損害程度呈正相關，并與T淋巴細胞滲透有關，其過度表達是由免疫反應中的炎癥因子激活，也是眼表炎癥的標志之一[14]。而p38MAPK被認為是炎癥反應中最重要的激酶，主要參與應激條件下細胞的免疫調節。p38MAPK的活性對正常的免疫與炎癥反應至關重要[15]，可以調控多種細胞因子、轉錄因子及細胞表面受體的表達，如IL-l、IL-6、TNF-α等。已有研究證實[16]，p38MAPK抑制劑SB203580可明顯減少炎性因子的生成，從而減輕過度的炎性反應。因此，通過干預p38MAPK信號轉導通路中相關信號分子的表達，就有可能對炎癥通路的信號轉導起到阻斷作用，從而抑制相關炎癥反應。

通過研究觀察發現，養陰潤目丸能有效增加實驗大鼠淚液分泌量，延長淚膜破裂時間，與模型組比較有顯著性差異，即通過去勢法造成的干眼模型是成功的。去勢造模三組分別同正常組、假手術組比較，大鼠結膜上皮細胞中的ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的陽性表達率均有顯著性差異，即大量陽性表達，再次印證p38MAPK通路與干眼關系密切。用養陰潤目丸治療的大鼠結膜上皮細胞中的ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的陽性表達率明顯低于模型組，且結膜上皮細胞的形態較之規則，著色程度較低，角化程度也明顯低于模型組，表明養陰潤目丸能有效下調結膜上皮細胞中p38MAPK蛋白的表達，從而抑制炎性反應，有效維持結膜上皮細胞正常的生長周期、形態及功能。實驗結果證實養陰潤目丸通過下調干眼大鼠結膜上皮細胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白含量，從實驗層面證明了養陰潤目丸治療干眼的有效性，其抑制炎癥、干預p38MAPK信號通路中關鍵信號分子的結果，均提示是養陰潤目丸治療干眼的作用機制。

根據以上結果認為，養陰潤目丸能有效治療干眼的機制可能是通過干預p38MAPK信號通路中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK的表達，來阻斷相關炎癥反應途徑，從而改善眼表干燥狀態。但是，ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK與p38MAPK信號通路上游或下游的相關信號分子的關系及調節機制如何有待進一步明確。根據對各組結膜上皮細胞的形態學觀察，是否有細胞凋亡等多重機制參與干眼發生發展有待進一步分析。

參考文獻：

[1]Lu NN, Liu L, Li J, et a1.Prevalence of and risk factors for dry eye symptom in mainland China: a systematic review and metaanalysis[J]. J Ophthalmology,2014, 2014:748654.

[2]Li JY,Zheng K,Deng K.et a1.Prevalence and risk factors of dryeye disease among a hospital -based population in Southeast China[J]. Eye Contact Lens, 2014，41(1)：44-50.

[3]李軍,李丹.干眼癥患者結膜上皮細胞和淚液中TNF-α、IL-1β的表達及意義[J].細胞與分子免疫學雜志,2010,26（11）:1128-1129.

[4]EI Anman J,Goyal S,Zhang Q,et al.Programmed Death-Ligand 1Regulates T cell Chemotaxis in Dry Eye-Associated Corneal Inflammation[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2010,51(7):3418-3423.

[5]Wu N, Lin X, Zhao X,et al. MiR-125b acts as an oncogene in glioblastoma cells and inhibits cell apoptosis through p53and p38MAPK-independent pathways[J]. Br Cancer,2013,109(11): 2853-2863.

[6]胡平,李點，廖亮英.養陰潤目丸對干眼癥大鼠結膜上皮細胞IL-1β、ICAM-1、p-p38MAPK的影響[J].湖南中醫雜志,2015,31（1）：137-139.

[7]孫洋,李點.滋陰潤目丸治療干眼癥40例臨床觀察[J].國際眼科雜志,2012,12（1）：168-169.

[8]魏世輝,王志軍.眼科實驗動物學[M].北京：人民軍醫出版社,2010: 92.

[9]馬軼群,王傳富,劉美光.去勢雄兔干眼癥模型角膜上皮細胞凋亡及相關基因表達的研究[J].眼科研究,2004，22（3）:286-289.

[10]姚小磊，彭清華，彭俊，等.密蒙花總黃酮對去勢導致干眼癥雄鼠血清LH的影響[J].湖南中醫藥大學學報,2013，33（7）:8-12.

[11]林靜.去勢雌干眼癥動物模型制作及發病機制的研究[J].眼科研究,2007，25（11）:814-817.

[12]Colligris B, Crooke A, Huete-Toral F,et al. An update on dry eye disease molecular treatment: advances in drug pipelines[J]. Expert Opin Pharmacother, 2014, 15(10): 1371-1390.

[13]Colligris B, Alkozi HA, Pintor J,et al. Recent developments on dry eye disease treatment compounds [J]. Saudi J Ophthalmol,2014, 28(1):19-30.

[14]龐潤暉,宋秀君.兔蒸發過強型干眼白細胞介素6、腫瘤壞死因子α和黏附分子1的表達[J].眼視光學雜志,2009,11(3):195-198.

[15]Chen Y,Zhang X,Yang L,et al.Decreased PPAR-γ expression in the conjun ctiaand increased expression of TNF-αand IL-1β in the conjunctiva and tear flUid of dry eye mice [J].Mol Med Rep,2014,9(5):2015-2023.

[16]Frangogiannis WG，SmithC W，Entman ML。Theinflammatory response in myocardial in fraction[J].Cardiovasc Res,2002,53(1)：31-47.

（本文編輯李杰）

〔作者簡介〕李點，女，主任醫師，教授，碩士研究生導師，研究方向；眼表疾病的中西醫防治。

〔基金項目〕湖南省自然科學基金資助項目（13JJ6063）；湖南省中醫藥科研計劃項目（2015117）。

〔收稿日期〕2015-09-06

〔中圖分類號〕R285.5；R276.7

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.11.004