六味地黃湯對IgA腎病大鼠α-SMA及FN表達的影響

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六味地黃湯對IgA腎病大鼠α-SMA及FN表達的影響

彭亞軍1，李旭華1，何澤云1*，廖春來1，何雅琴1，胡淑娟2

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007；2.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208）

〔摘要〕目的觀察六味地黃湯對IgA腎病大鼠α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）及纖維連接蛋白（fibronectin，FN）表達的影響，進一步探討其可能作用機制。方法SD大鼠40只隨機分為正常對照組、模型組、雷公藤多苷片組，六味地黃湯組。除正常對照組外均采用牛血清白蛋白+脂多糖+四氯化碳方法建立實驗性IgA腎病模型。造模成功后分組干預連續灌胃4周，分別在每周末檢測尿蛋白定量及尿紅細胞計數，第4周末處死各組大鼠，進行腎功能檢測。采用免疫組化、Western blot檢測各組α-SMA及FN蛋白表達，進行半定量分析。結果各組尿蛋白定量及尿紅細胞計數比較，模型組較正常組顯著升高（P＜0.05），而六味地黃湯組與模型組比較顯著降低（P＜0.05）,差異有統計學意義；各組α-SMA和FN表達，模型組較正常組表達顯著升高（P＜0.05），而六味地黃湯組較模型組表達下降，（P＜0.05）差異有統計學意義。結論六味地黃湯可減少IgA腎病大鼠尿蛋白及尿紅細胞數，改善其腎功能，可能與通過下調α-SMA及FN表達相關。

〔關鍵詞〕IgA腎病；六味地黃湯；α-平滑肌肌動蛋白；纖維連接蛋白

Effects of Liuwei Dihuang Decoction onthe Expression of α-SMA and FN in IgA Nephropathy Rats

PENG Yajun1，LI Xuhua1，HE Zeyun1*，LIAO Chunlai1，HE Yaqin1，HU Shujuan2

（1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410007，China；2. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208，China）

〔Abstract〕Objective To observe the effects of Liuwei Dihuang Decoction on the expression of α-SMA and fibronectin (FN) in IgA nephropathy rats, and further investigate its possible mechanism. Methods Forty SD rats were equally randomly divided into 4groups: the normal group, model group, tripterygium glycosides tablets group and Liuwei Dihuang Decoction group. IgAN rat models were established with bovine serum albumin (BSA), lipopolysaccharide (LPS) and carbon tetrachloride (CCl4). The successfully established models were given 4weeks of continuous perfusion. The proteinuria and urinary red blood cell count were detected every week, respectively. At fourth weekend, all the rats were killed for kidney function test. The α-SMA and FN protein expression of each group were detected by using immunohistochemistry and Western blot, and semi-quantitative analysis was made. Results The urine protein and urine red blood cell countsin each group were compared, the model group was higher significantly than that of normal group(P <0.05), while compared with mode group, Liuwei Dihuang Decoction group was decreased significantly(P <0.05), the difference was statistically significant.The α-SMA and FN expression in model group were increased than that in the normal group, while the expression of Liuwei Dihuang decoction group was decreased comparing with the model group(P<0.05), the difference was statistically significant. Conclusion Liuwei Dihuang Decoction can reduce the urine protein and urine red blood cell count of IgA nephropathy rats and improve the kidney function, which may be related with down-regulation of α-SMA and FN expression.

〔Keywords〕IgA nephropathy; Liuwei Dihuang Decoction;α-smooth muscle actin; fibronectin

IgA腎病是一組以腎小球系膜區IgA沉積、同時伴有系膜細胞增生和系膜基質擴張為主要病理改變的原發性腎小球腎炎，其臨床表現多種多樣，主要表現為血尿，可伴有不同程度的蛋白尿、高血壓和腎功能受損，是導致終末期腎病常見的原發性腎小球疾病之一[1]。IgA腎病的病因及發病機制均尚未明確，多種因素可導致IgA腎病的發生發展，而系膜細胞增殖及細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積是導致腎小球硬化甚至腎功能衰竭的主要因素。臨床及實驗研究表明[2-3]六味地黃丸為防治慢性腎臟病有效方藥之一，本實驗將通過研究六味地黃湯對IgA腎病大鼠α-平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）及纖維連接蛋白（fibronectin，FN）表達的影響，探討其可能作用機制，為其臨床運用提供進一步理論依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物

清潔級雄性SD正常大鼠40只，體質量（150± 20）g，購于長沙斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(湘)2011-0003。

1.2實驗藥物

六味地黃湯（熟地黃24g、山茱萸12g、山藥12g、澤瀉9g、茯苓9g、牡丹皮9g），均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科，經水煎、過濾、濃縮至1g/mL，置4℃冰箱保存。雷公藤多苷片，生產廠家：江蘇美通制藥有限公司，批號：Z32021007。

1.3主要試劑

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），美國MBCHEM公司；四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4），脂多糖（lipopolysaccharide, LPS），美國Sigma公司；兔抗大鼠α-SMA單克隆抗體，美國Cell Signaling Technology公司；兔抗大鼠FN單克隆抗體，美國Abcam公司；大鼠Anti-beta-Actin單克隆抗體，康為世紀生物技術有限公司；免疫組化試劑盒PV6300、SABC試劑盒及DAB顯色試劑盒均采購于北京中杉金橋生物技術有限公司；尿蛋白定量、血肌酐及尿素測定試劑盒均采購南京建成生物工程研究所。

1.4主要儀器

RT-1904C半自動生化儀，美國雷杜；R/S 2003UF尿沉渣分析儀，美國戴西斯；電泳儀，美國Bio-Rad公司；轉膜儀，美國Bio-Rad公司；WD-9405A脫色搖床，沃德生物醫學儀器公司；倒置顯微鏡IX51，日本Olympus公司；IPP6.0醫學圖像分析系統，美國Media Cybermetics公司；Gel pro4.0圖像分析軟件，美國Media Cybermetics公司。

1.5分組、造模及給藥

大鼠按隨機數字表法分為正常對照組、模型組、六味地黃湯組、雷公藤多苷組，每組10只。除正常對照組外，其他組根據文獻[4]，運用BSA+LPS+ CCl4方法建立實驗性IgA腎病模型，方案如下：口服免疫原BSA 400mg/kg隔天灌胃，持續6周；皮下注射蓖麻油0.5mL+CCl40.10mL，每周1次，持續9周；并聯合運用LPS（分別于第6、8周以LPS 0.05mg尾靜脈注射）。造模成功后連續灌胃4周，六味地黃湯組予以六味地黃湯灌胃，劑量為6.75g/kg生藥，相當于60kg體質量成人每天75g生藥的等效劑量，模型組及正常組用等體積蒸餾水灌胃，雷公藤多苷片組6mg/（kg·d）溶于等體積生理鹽水灌胃，各組每天灌胃1次。

1.6觀察指標及方法

1.6.1尿紅細胞及尿蛋白定量檢測每周末用代謝籠收集尿液，用量筒測定尿量，采用CBB法檢測尿蛋白定量，將收集尿液5mL先以1500轉/min離心5min，傾取上清液，用管底的沉渣以尿沉渣分析儀進行分析尿紅細胞計數。

1.6.2腎功能檢測采用美國雷杜半自動生化儀，苦味酸法檢測血肌酐，酶偶聯速率法檢測尿素氮。

1.6.3免疫組織化學法檢測實驗結束后取左腎皮質，置入40g/L多聚甲醛液中于4℃下固定24h，常規脫水，石蠟包埋后行冠狀位切片，片厚3～4μm。切片常規脫蠟至水；置于二甲苯前用烤箱加熱30min；經30%H2O2甲醇處理，室溫孵化20min以滅活內源性過氧化物酶；微波爐加熱修復抗原；每張切片滴加一滴山羊血清封閉，置于濕盒中封閉30min；滴加一抗α-SMA或FN（工作濃度約為1：200）后放置于免疫組化保濕盒37℃孵育2h；充分漂洗；加入相應生物素化二抗；37℃孵育30min，PBS洗滌；DAB顯色：蘇木素輕度復染，脫水，透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察，陽性染色細胞胞漿或胞膜出現黃色或棕黃色顆粒，胞核呈藍色。采用IPP6.0醫學圖像分析系統，每個組分別選取5張切片，每張切片隨機選取5個腎皮質視野，測定陽性著色平均光密度（OD）值進行圖像分析。

1.6.4Western blot法檢測從-80℃取100mg腎組織皮質放入研缽中，用研磨棒碾碎成粉末，最后將碾碎的組織粉末轉移至加入1mL裂解液的EP管中，4℃，12000轉/min，離心5min，取上清液，采用BCA法蛋白濃度的測定；SDS-PAGE轉膜印跡；用5%脫脂奶粉室溫封閉1h；用PBST配置的封閉液稀釋α-SMA（1:1000）、FN(1:1000)，betaactin（1:1500），4℃中孵育過夜，孵育結束后用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次；二抗用PBST稀釋至適當濃度，孵育步驟同一抗，二抗室溫下孵育1h后，用PBST在室溫下脫色搖床上洗3次；應用ECL法進行顯影檢測。采用圖像分析軟件Gel pro4.0進行平均光密度值（integrated optical density，IOD）分析。用以所測得的各指標的平均光密度值與相應的內參照平均光密度值的比值代表目的蛋白的相對表達量。

1.7統計方法

2　結果

2.1一般情況觀察

造模后，模型組大鼠造模前4周飲食飲水、毛發色澤、活動度、外界反應情況均未見明顯變化；在造模第4周模型組個別大鼠不同程度的食欲差、毛色雜亂、精神萎靡蜷縮，活動度下降，在第6周后上述情況有所改善，第4周模型組死亡1只，其原因不明，正常對照組大鼠飲食飲水精神及活動度均正常，無大鼠死亡。

2.2各組大鼠給藥后尿紅細胞計數變化情況

模型組在第1、2、3及4周末尿紅細胞計數均顯著高于正常對照組（P＜0.05）；六味地黃湯組第1周末尿紅細胞計數與模型組及雷公藤多苷片組比較無顯著變化，差異無統計學意義（P＞0.05）；六味地黃湯組在第2、3、4周末與模型組相比較，尿紅細胞計數低于模型組，且差異有統計學意義（P＜0.05）；六味地黃湯組在第2、3、4周末與雷公藤多苷片組相比，尿紅細胞計數均高于雷公藤多苷片組，差異有統計學意義（P＜0.05）；六味地黃湯組第4周末與第1周末前后比較，尿紅細胞計數明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1　各組大鼠尿紅細胞計數變化情況　(±s，個/μL）

表1　各組大鼠尿紅細胞計數變化情況　(±s，個/μL）

注：與正常對照組比較△P＜0.05；與模型組比較□P＜0.05；與雷公藤多苷片組比較#P＜0.05；與六味地黃湯組第1周比較▲P＜0.05。

組別　第1周　第2周　第3周　第4周正常對照組模型組雷公藤多苷片組六味地黃湯組8.1±1.6320.4±15.4△308.1±17.8316.9±15.98.7±2.2335.0±21.6△289.9±15.7305.4±15.1#□9.6±1.8334.0±32.9△263.7±22.9281.4±18.3#□10.5±2.7344.1±21.16△187.7±16.5238.1±15.5#□▲

2.3各組大鼠給藥后24小時尿蛋白定量變化情況

模型組在第1、2、3及4周末尿蛋白定量均顯著高于正常對照組（P＜0.05）；六味地黃湯組第1周末尿蛋白定量與模型組及雷公藤多苷片組比較無顯著變化，差異無統計學意義（P＞0.05）；六味地黃湯組在第2、3、4周末與模型組相比較，尿蛋白定量顯著低于模型組，且差異有統計學意義（P＜0.05）；六味地黃湯組在第2、3、4周末與雷公藤多苷片組相比，尿蛋白定量均高于雷公藤多苷片組，差異有統計學意義（P＜0.05）；六味地黃湯組第4周末與第1周末前后比較，尿蛋白顯著減少且差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2　各組大鼠給藥后24小時尿蛋白定量變化情況(±s，mg）

表2　各組大鼠給藥后24小時尿蛋白定量變化情況(±s，mg）

注：與正常對照組比較△P＜0.05；與模型組比較□P＜0.05；與雷公藤多苷片組比較# P＜0.05；與六味地黃湯組第1周比較▲P＜0.05。

組別　第1周　第2周　第3周　第4周正常對照組模型組雷公藤多苷片組六味地黃湯組2.01±0.4116.62±1.65△14.01±0.9115.26±0.881.83±0.3818.48±1.15△11.96±1.3213.56±1.19#□1.91±0.2619.54±1.42△10.65±0.5412.92±1.32#□1.97±0.2021.56±1.66△9.27±0.8512.57±1.29#□▲

2.4各組大鼠給藥后腎功能測定

六味地黃湯組及雷公藤多苷片組BUN、Cr含量較模型組無明顯下降，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3　各組大鼠給藥后腎功能比較　(±s）

表3　各組大鼠給藥后腎功能比較　(±s）

組別n BUN（mmol/L）Cr（umol/L）正常對照組模型組雷公藤多苷片組六味地黃湯組10910103.92±0.678.03±0.867.05±0.787.42±0.5032.35±5.1372.50±4.7366.20±3.5069.64±2.31

2.5各組大鼠腎臟組織α-SMA及FN表達情況

2.5.1各組免疫組織化學檢測α-SMA及FN表達與分析正常對照組腎小球、腎小管及腎間質α-SMA及FN基本不表達；模型組腎小球系膜區、腎小管及間質均有大量棕褐色陽性表達，雷公藤多苷片組及六味地黃湯組腎小球系膜區及小管間質均較模型組表達弱；經半定量分析，六味地黃湯組α-SMA及FN表達與模型組相比明顯降低，且差異有統計學意義（P＜0.05）；與雷公藤多苷片組相比，六味地黃湯組α-SMA及FN表達較高，且差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4，圖1-2。

表4　各組大鼠腎臟組織α-SMA表達平均光密度比較　(±s）

表4　各組大鼠腎臟組織α-SMA表達平均光密度比較　(±s）

注：與模型組比較*P＜0.05；與雷公藤多苷片組比較#P＜0.05。

組別正常對照組模型組雷公藤多苷片組六味地黃湯組F值n 1091010α-SMA OD值259.07±12.40736.85±79.68590.88±40.77654.74±36.82*#13.245FN OD值19.23±3.99120.81±8.2981.46±10.08104.81±9.36*#16.746

圖1　各組免疫組化α-SMA光鏡圖（×400）

圖2　各組免疫組化FN光鏡圖（×400）

2.5.2各組Western blot檢測α-SMA及FN表達與分析正常對照組α-SMA及FN蛋白表達水平低，與模型組、雷公藤多苷片組、六味地黃湯組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比較，六味地黃湯組α-SMA及FN蛋白表達下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；六味地黃湯組α-SMA及 FN蛋白表達較雷公藤多苷片組升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3，表5。

表5　各組大鼠腎臟組織α-SMA蛋白相對表達量比較(±s）

表5　各組大鼠腎臟組織α-SMA蛋白相對表達量比較(±s）

注：與模型組比較*P＜0.05；與雷公藤多苷片組比較#P＜0.05。

組別正常對照組模型組雷公藤多苷片組六味地黃湯組F值n 1091010α-SMA/β-actin 0.172±0.0480.797±0.1110.461±0.0750.648±0.090*#9.231FN/β-actin 0.167±0.0611.182±0.2170.732±0.1100.929±0.080*#7.453

圖3　各組大鼠腎組織Western blot檢測α-SMA及FN蛋白表達電泳圖

3　討論

IgA腎病發病機制尚不明確，多種因素可導致IgA腎病的發生發展，可能的遺傳因素、上呼吸道感染所產生的細胞因子以及其他未知的因素導致免疫球蛋白IgA的血清含量增加以及O-糖鏈的糖基化異常、而不能被正常清除，循環到達腎臟，通過腎小球毛細血管孔徑較大的內皮連接，沉積系膜區，激活系膜細胞，導致系膜細胞增殖和分泌表型的改變，從而導致系膜細胞分泌大量的物質，調節炎癥反應，以及腎小球微循環和ECM的沉積，影響腎小球功能[5]。

研究表明[6]，細胞外基質合成增加或降解減少，均可導致腎小球或腎間質過度沉積，最終形成腎小球硬化或腎間質纖維化。正常情況下，腎小球系膜細胞維持收縮、吞噬和保持ECM正常代謝功能，但在病理情況下，系膜細胞受到一些因素的刺激后可發生明顯增殖，并產生細胞因子和ECM，細胞因子又能進一步刺激系膜細胞進一步增殖和產生更多的ECM，導致ECM積聚[7]。體內外實驗均表明，腎小球系膜細胞在一定條件下可發生表型轉化，轉化為肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB）[8]。肌成纖維細胞具有平滑肌細胞和成纖維細胞的特性，既具有收縮功能，又能產生膠原和ECM成分，α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是肌成纖維細胞表型標志，體內靜息狀態的成熟腎小球系膜細胞沒有或極少表達α-SMA，但是，在IgA腎病時，腎小球系膜細胞表達α-SMA明顯增加，并出現增殖和分泌大量ECM。Silva GE[9]等研究表明α-SMA等觀察指標與IgA腎病預后相關。同樣Yao J[10]等從74例IgA腎病患者發現病理等級及臨床指標均與α-SMA表達正相關，α-SMA的表達可作為評估IgA腎病預后的標志物。

作為活化成纖維細胞，MFB合成膠原等ECM的能力更強，MFB首先分泌纖維連接蛋白（fibronectin FN），為其他ECM成分的沉積和膠原纖維的形成提供支架，之后分泌Ⅰ和Ⅲ膠原，LN和蛋白聚糖等。FN是一種非膠原性的a2糖蛋白[11]。纖維連接蛋白先與纖維蛋白、纖維蛋白原及膠原結合，才可將其他膠原沉積于腎小球及小管間質，FN作為這些細胞外基質成分之間的中心環節而起作用，同時其也是一種重要的調理介質，通過與整合素的結合介導細胞增值與器官硬化過程中起著重要作用[12]。Federica[13]研究證實FN1突變后引起腎小球FN的沉積，導致纖維連接蛋白腎小球病的發生。同樣Chen H[14]報道了10例纖維連接蛋白腎小球病纖維連接蛋白染色腎小球陽性100%，均說明了FN沉積對導致慢性腎小球疾病具有重要作用。

六味地黃丸是古方經典滋陰補腎之劑，被廣泛運用于慢性腎臟病防治。本實驗結果顯示，從六味地黃湯組尿蛋白定量及紅細胞計數與模型組比較，均較模型組降低（P＜0.05），但較雷公藤多苷片組高，這也提示六味地黃湯可在一定程度上減少IgA腎病大鼠尿蛋白及尿紅細胞，這與國內一些臨床研究[15]一致。同時在一定程度上改善腎功能。通過對各組α-SMA及FN半定量分析發現，模型組腎小球系膜區、腎小管及間質均有大量棕褐色陽性表達及Western blot檢測α-SMA及FN增多,這也提示模型組大鼠腎臟系膜細胞及上皮細胞發生了表型轉化，從成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，同時分泌大量細胞外基質，而六味地黃湯組α-SMA及FN表達平均光密度、Western blot檢測α-SMA及FN，與模型組相比，均明顯降低，且差異有統計學意義（P＜0.05）。與雷公藤多苷片組相比，六味地黃湯組免疫組化及Western blot檢測FN、α-SMA表達均較高，且差異有統計學意義（P＜0.05），結合雷公藤多苷對其尿蛋白、尿紅細胞及腎功能的影響，這也進一步說明雷公藤多苷片治療IgA腎病具有較好療效，由于我們對六味地黃湯其治療觀察時間短、且無劑量分層，能否達到與雷公藤多苷片一樣的療效，還有待進一步研究。

綜上所述，六味地黃湯可在一定程度上減少I-gA腎病大鼠尿蛋白及尿紅細胞數，改善其腎功能，其機制可能通過下調α-SMA及FN表達，而達到減少腎臟ECM等沉積，一定程度上延緩腎小球及間質的纖維化，其影響其表達的調控因素或信號傳導途徑，有待進一步探討。

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（本文編輯楊瑛）

〔通訊作者〕*何澤云，男，教授，博士生導師，E-mail：hzy2005@zjy.edu.cn。

〔作者簡介〕彭亞軍，男，博士，從事慢性腎臟病防治研究。

〔基金項目〕湖南省科技廳項目基金（2013SK3099）。

〔收稿日期〕2015-09-04

〔中圖分類號〕R285.5；R692.3+1

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.11.006