侵染油茶的兩種病原菌的鑒定及其生物學特性研究

史紅安+傅本重+張志林+李國元+王立華

摘要：為了掌握湖北孝感本地油茶（Camellia oleifera）主要病害發生規律，采用常規組織分離法分離病原菌，依據病原菌的形態特征，結合其rDNA-ITS序列分析，對油茶病原菌進行分離和分子鑒定，并對其生物學特性進行了研究。結果表明，鑒定兩種病原菌分別為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和鏈格孢（Alternaria ?alternata）;炭疽病菌菌株在PDA培養基中生長最快，最適碳源和氮源分別為淀粉、硫酸銨，pH 6.0為宜，最適生長溫度為25 ℃，致死溫度為52 ℃;鏈格孢菌株最適培養基為PDA培養基，以淀粉為碳源、硝酸銨為氮源為宜，pH 8.0時菌絲生長最快，最適溫度為25 ℃，致死溫度為54 ℃。

關鍵詞：油茶（Camellia oleifera）;病原菌;膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）;鏈格孢（Alternaria alternata）;生物學特性

中圖分類號：S432.4+4 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）23-5908-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.028

The Study of Two Camellia Pathogens Isolation，

Identification and Biological Characteristics

SHI Hong-an1，2，FU Ben-zhong1，ZHANG Zhi-lin1，LI Guo-yuan1，WANG Li-hua1

（1.Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables，Hubei Engineering University， Xiaogan 432000，

Hubei， China;2. College of life science， Hubei University，Wuhan ?430062，China）

Abstract： The two Camellia pathogens were isolated， identified， and the primary biological characteristics were determined. By using routine isolation method from tissue， following morphological characteristics， combining with the result of the rDNA-ITS sequence analysis， the two pathogens were identified as Colletotrichum gloeosporioides and Alternaria alternata，respectively.The test showed the pathogen C. gloeosporioides grew best in PDA media，starch as carbon source，ammonium sulfate as nitrogen source，pH 6.0， the optimum temperature was 25 ℃ and the lethal temperature was 52 ℃;For A. alternata，which grew best in CMM， starch as the carbon source，ammonium nitrate as nitrogen source，pH 8.0，the optimum temperature was 25 ℃， and the lethal temperature was 54 ℃.

Key words： Camellia oleifera; pathogen; Colletotrichum gloeosporioides; Alternaria ?alternata; characteristics

油茶（Camellia oleifera）屬山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia），是中國特有的一種高級油料作物，主要生長于中國南方亞熱帶地區高山及丘陵地帶，是重要的木本油料樹種之一[1]。油茶炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）是油茶的主要病害之一，該病在中國各油茶產區普遍發生，油茶的地上各部位均可受害，主要引起落果、落蕾、枝梢枯死、枝干潰瘍、甚至整株死亡[2]。病落果率通常在20%左右，有時高達40%以上。近年來，湖北油茶種植規模不斷擴大，相應的病害逐步引起重視。尤其是苗圃的病害發生嚴重，苗木調運也能引起病害傳播，因此，對苗圃的病原菌檢測顯得尤為重要。目前對油茶炭疽病的防治只有通過種植抗性品種和化學防治來控制。本試驗對引起湖北孝感本地油茶炭疽病的病原菌進行了鑒定，并對病原菌的生物學特性進行初步研究，為防治該病害提供理論依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?病原菌的分離、純化及存種

于2013年10月從湖北省孝感市油茶苗木基地采集病株標本。油茶品種為長林2號。

采用常規組織分離法[3]分離病原菌，從病葉病健交界處切取長約3 cm的組織，用清水沖洗表面雜物，置于0.1%的酸性升汞水溶液中2 min，取出用去離子水沖洗2次，再用體積分數為70%乙醇處理30 s，去離子水沖洗3次，在無菌條件下接種至PDA培養基上，于28 ℃培養箱中恒溫培養，待菌落長出后，移入另一平板培養。經過3次以上純化，將所獲菌株編號接種于試管斜面，待菌落長出后，于4 ℃保存。endprint

1.2 ?病原菌鑒定

1.2.1 ?病原菌形態學特征觀察 ?將純化后的菌種轉接到PDA平板上，置于25 ℃條件下培養5 d，觀察記載菌落形態、顏色、基質顏色及分生孢子形態特征，作為鑒定病原菌的主要形態學依據。參照魏景超[4]、陸家云[5]的方法進行病原菌鑒定。

1.2.2 ?病原菌rDNA-ITS的擴增與序列分析 ?病原菌DNA提取參考何月秋[6]的方法。選取無污染且生長良好的5～6 d菌3皿，用滅菌刀片刮取菌絲，稱重后得到DNA，置于-20 ℃保存。

采用真菌的通用引物ITS4和ITS5進行PCR擴增，引物序列為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA-3′[7]。PCR反應總體系為50 μL，反應液為引物ITS4和ITS5（上海生工生物工程有限公司） 各0.5 μL、10×buffer 5 μL、dNTP 5 μL、Taq酶0.4 μL、MgCl2 5 μL、去離子水32.6 μL。 PCR擴增條件： 94 ℃預變性5 min，94 ℃變性50 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環;最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，通過凝膠成像系統顯示記錄電泳結果。PCR產物委托上海生工生物工程有限公司進行純化和測序。

1.3 ?病原菌生物學特性測定

1.3.1 ?培養基試驗 ?馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。沙堡弱培養基（SDA）：葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。燕麥培養基（OA）：燕麥片30 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。玉米粉培養基（CMM）：玉米粉40 g、蔗糖10 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。查氏培養基（CZ）：蔗糖30 g、硝酸鈉2 g、氯化鉀0.50 g、硫酸亞鐵0.010 g、磷酸二氫鉀1 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。取培養5 d的病原菌，用打孔器取直徑6 mm的菌餅分別接種在5種培養基平板中央，每個處理重復3次，于28 ℃培養箱培養5 d后，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3.2 ?碳源試驗 ?以查氏培養基[8]為基礎培養基，分別以葡萄糖、肌醇、D-果糖、乳糖、可溶性淀粉代替蔗糖，取培養5 d直徑6 mm的菌餅分別接種在上述培養基平板中央，每個處理重復3次，于28 ℃培養箱培養5 d后，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3.3 ?氮源試驗 ?以查氏培養基為基礎培養基，分別以硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、草酸銨、甘氨酸代替硝酸鈉，取培養5 d的病原菌，用打孔器取直徑6 mm菌餅分別接種在上述培養基平板中央，每個處理重復3次，于28 ℃培養箱培養5 d后，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3.4 ?pH試驗 ?以PDA培養基為基礎培養基，用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH溶液調節pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，共8個梯度，取培養5 d的病原菌，用打孔器取直徑6 mm的菌餅接種在供試8個梯度平板中央，每個處理重復3次，于28 ℃培養箱培養5 d后，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3.5 ?溫度試驗 ?以PDA培養基為基礎培養基，取培養5 d的病原菌，用打孔器取直徑6 mm菌餅分別接種在平板中央，分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃中培養，每個處理重復3次，培養5 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3.6 ?致死溫度試驗 ?將直徑6 mm的菌餅置于裝有5 mL的去離子水中，將試管分別置于48、49、50、51、52、53、54、55 ℃的恒溫水浴鍋中處理10 min后迅速冷卻，再將菌餅取出置于PDA培養基上，每個處理重復3次，于28 ℃培養箱培養5 d后，用十字交叉法測量菌落直徑。

2 ?結果與分析

2.1 ?病原菌鑒定

2.1.1 ?病原菌分離與形態鑒定 ?從油茶病葉上分離得到20株菌株，所對應的編號為XCGO1-20，根據形態特征將菌株分為兩類（XCGO1、2、3、5、13、14、15、16、20為一類，剩余的為一類），以XCGO1、XCGO4（圖1-A、1-B）為代表。XCGO1呈圓形生長，初為白色，絨毛狀，逐漸呈深褐色，分生孢子為棕紅色，并且色素滲入培養基內，菌落終為棕紅色。XCGO4呈同心輪紋生長，初為深綠色，菌落終為中央黑色，外部青褐色，邊緣色淺。

2.1.2 ?顯微狀態特征 ?XCGO1顯微結構觀察結果（圖1-C）表明，分生孢子單胞，無色光滑，棒狀，兩端圓鈍，大小為（13.41～15.96） μm×（5.19～5.63） μm，平均15.32 μm×5.56 μm。XCGO4顯微結構觀察結果（圖1-D）表明，分生孢子多數呈倒梨形或近卵狀，偶見狹棒狀或倒棒狀，黃褐色至褐色，具橫膈3～7個，縱斜膈膜0～4個，分生孢子大小為（24.4～48.9） μm×（7.3～12.2） μm，平均4.5 μm×9.2 μm。

2.1.3 ?病原菌rDNA-ITS的分析 ?XCGO1、XCGO4的PCR擴增產物，經測序分析確定片段全長分別為519 bp和506 bp。兩個菌株rDNA-ITS基因系統發育結果顯示，菌株XCGO1序列與GenBank 登錄號JX010152（C. gloeosporioides）的同源性達到99%，確定為膠孢炭疽病菌（C. gloeosporioides）（圖2）。菌株XCGO4序列與GenBank登錄號KJ716876（Alternaria alternata）的同源性達到100%，確定為鏈格孢（A. alternata）（圖3）。endprint

2.2 ?病原菌生物學特性測定

2.2.1 ?培養基對菌絲生長的影響 ?菌株XCGO1、XCGO4在以上5種培養基上均能生長，菌株XCGO1在PDA培養基上生長速率高于其他培養基，CMM培養基次之;菌株XCGO4在PDA培養基上生長速率顯著高于其他培養基，CZ培養基上的生長速率最低（表1）。

2.2.2 ?碳源對菌絲生長的影響 ?在供試的5種碳源中，菌株XCGO1在以淀粉為碳源的培養基上生長最快，菌絲生長速率達到6.4 cm/d，顯著高于其他供試碳源;菌株XCGO4在以淀粉為碳源的培養基上生長最快，菌絲生長速率達到7.5 cm/d（表2）。

2.2.3 ?氮源對菌絲生長的影響 ?在供試的5種氮源中，菌株XCGO1在以硫酸銨為氮源的培養基上生長最快，菌絲生長速率達到6.0 cm/d;菌株XCGO4 在以硝酸銨為氮源的培養基上生長最快，菌絲生長速率達到6.7 cm/d（表3）。

2.2.4 ?pH對菌絲生長的影響 ?如圖4所示，在pH 4～11范圍內，兩種病原菌菌絲均能生長，菌株XCGO1在pH 6時最適生長，菌落直徑達到6.40 cm，在pH 4時菌絲生長最弱，菌落直徑只有5.28 cm。菌株XCGO4在pH 8時最適生長，菌落直徑達到6.45 cm，在pH 4時菌絲生長最弱，菌落直徑僅3.40 cm。

2.2.5 ?溫度對菌絲生長的影響 ?圖5表明，病原菌菌絲在20～30 ℃均能較好生長，菌落直徑明顯大于其他溫度。其中25 ℃是兩種菌株的最適生長溫度，菌株XCGO1的菌絲生長速度較菌株XCGO4快。溫度低于10 ℃或高于30 ℃時生長速度顯著下降。

2.2.6 ?致死溫度試驗 ?致死溫度試驗結果表明，菌株XCGO1在52、53、54、55 ℃高溫處理10 min后，沒有菌絲生長，表明菌株XCGO1的致死溫度為52 ℃，致死時間為10 min。菌株XCGO4在54、55 ℃高溫處理10 min后，沒有菌絲生長，表明菌株XCGO4的致死溫度為54 ℃，致死時間為10 min。

3 ?小結與討論

僅根據生物學形態特征對病原菌進行鑒定和分類是不夠的，ITS序列在炭疽菌的鑒定中的應用為其鑒定提供了有力的依據。本研究綜合病原菌的形態學特征、生物學特性以及rDNA-ITS序列分析結果，鑒定出引起油茶病害的病原菌為C. gloeosporioides和A. alternata。本研究中C. gloeosporioides的形態特征與葉航等[9]報道的油茶炭疽病病原菌特征相似。A. alternata與周求根等[10]研究的貢梨黑斑病病原菌形態特征相似。該病原菌自1933年在果樹上報道以來，再次在油茶上發現并報道。通過對其生物學的研究發現，兩種病原菌在供試的培養基中均能生長，不存在差異。炭疽病菌菌株以淀粉為最適碳源、硫酸銨為最適氮源、pH 6.0為宜，最適生長溫度為25 ℃，致死溫度為52 ℃;鏈格孢菌株以淀粉為最適碳源、硝酸銨為最適氮源，pH 8.0時菌絲生長最快，最適生長溫度為25 ℃，致死溫度為54 ℃。

中國擁有豐富的油茶種質資源，南方大部分地區都適宜生長。油茶不僅營養價值豐富，而且大力發展油茶是解決中國食用油安全問題的重要途徑之一，但病害對油茶產量有很大的影響。葉航等[9]在田間觀察發現，不同油茶物種、品種炭疽病的發病率不同，即使是同一品種，不同部位的發病率也不一樣。分離于油茶葉片的油茶炭疽病原菌有利于病菌種群劃分。本文通過對油茶病原菌的鑒定，以及病原菌的生物學特性研究，為油茶病害的綜合治理提供理論基礎。

參考文獻：

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[5] 陸家云.植物病原真菌學[M].北京：中國農業出版社，2001.

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[8] 王 ?宏，常有宏，陳志誼.梨黑斑病病原菌生物學特性研究[J].果樹學報，2006，23（2）：247-251.

[9] 葉 ?航，韋 ?維，吳 ?波，等.油茶炭疽病病原菌的分離和初步鑒定[J].江西農業大學學報，2014，36（2）：314-318.

[10] 周求根，李 ?誠，蔣軍喜，等.貢梨果實黑斑病病原菌鑒定及室內防治藥劑篩選[J].中國南方果樹，2013，42（5）：35-38.endprint