栗疫病菌對苯醚甲環唑和氟硅唑的敏感性分析

何秀娟+徐育海+邱文明

摘要：采用菌絲生長速率法檢測來自湖北羅田板栗產區14株栗疫病菌對苯醚甲環唑和氟硅唑的敏感性。結果表明，苯醚甲環唑對14株栗疫病菌株的EC50范圍為0.027 9～0.124 0 μg/mL，平均為0.064 5 μg/mL;氟硅唑對上述菌株的EC50為0.024 6～0.218 6 μg/mL，平均為0.072 5 μg/mL。對不同敏感性菌株的適生性進行檢測。結果表明，抗藥性較強的菌株菌絲生長速率和致病力顯著高于敏感菌株;抗性菌株傳代培養10代后的EC50沒有顯著性變化，其抗藥性狀可以穩定遺傳。

關鍵詞：栗疫病;抗藥性;苯醚甲環唑;氟硅唑

中圖分類號：S432 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）23-5915-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.030

The Sensitivity of Chestnut Blight to Difenoconazole and Flusilazole

HE Xiu-juan， XU Yu-hai， QIU Wen-ming

（Institute of Fruit and Tea， Hubei Academy of Agricultural Science， Wuhan 430064， China）

Abstract：The sensitivities of chestnut blight to difenoconazole and flusilazole fungicides were determined in 14 isolates collected from Luotian in Hubei Province by measuring the mycelial growth on PSA media. The results showed that the 50% effective concentration values（EC50） of difenoconazole ranged from 0.027 9 to 0.124 0 μg/mL，with a mean of 0.064 5 μg/mL.And the EC50 values of flusilazole ranged from 0.024 6 to 0.218 6 μg/mL，with a mean of 0.072 5 μg/mL.The fitness test of different sensitive isolates showed that the mycelial growth rate of resistant isolates was faster and the pathogenicity was higher than sensitive isolate significantly. After being subcultured for ten generations，EC50 of the resistant isoltes remained at the same level，the resistance of the isolates may be stable.

Key words： chestnut blight; fungicide resistance; difenoconazole; flusilazole

栗疫病又稱栗胴枯病、栗干枯病，該病引起板栗樹皮腐爛、枯枝或全樹枯死，甚至大片栗樹死亡，是著名的森林病害，廣泛發生于亞洲、歐洲和北美洲。栗疫病在中國分布十分廣泛[1]，生產上板栗的病蟲害管理環節較為薄弱，因栗疫病嚴重發生而造成的毀園現象時有發生，并呈上升趨勢，栗疫病的防治是栗樹栽培中亟待解決的問題。

國家開展了栗疫病的防治研究，在栗疫病抗病育種[2]、弱病毒菌株生物防治[3]等研究方向均取得了一定的進展。中國位于栗疫病菌的起源中心[4]，栗疫病菌資源遺傳背景和營養體多樣性復雜[5]，上述防治方式在實際生產中的應用還存著一定的困難[6，7]。栗疫病病原菌是寄生隱叢赤殼菌[Cryphonectria parasitica （Murr.） Barr]，屬子囊菌亞門。栗疫病防治難度大，一旦發生很難根除。苯醚甲環唑和氟硅唑是三唑類殺菌劑，具內吸性，其作用機理為影響甾醇類生物合成，使菌體細胞膜功能受到破壞，由于廣譜高效的抗菌活性和中等的抗藥性風險，被廣泛用于農業生產中植物真菌病害的防治[8，9]。在板栗實際生產中，化學殺菌劑應用較少，早期的化學藥劑對栗疫病防治效果不明顯，尚沒有登記用于板栗疫病防治的化學藥劑。本研究從湖北羅田縣受栗疫病侵染的板栗園分離得到栗疫病菌株并開展相關研究[10，11]，本試驗在室內條件下測定分離獲得的14株栗疫病菌株對苯醚甲環唑和氟硅唑的敏感性，探索化學藥劑在栗疫病防治上的應用潛力，以期為栗疫病的化學防治提供理論依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?供試藥劑

苯醚甲環唑（瑞德豐世典水分散粒劑，有效成分10%），廣東省東莞市瑞德豐生物科技有限公司;氟硅唑（福星乳油，有效成分400 g/L），美國杜邦公司。

1.2 ?供試菌株與培養條件

從湖北羅田板栗產區采集栗疫病病斑樹皮樣本，經組織分離、鑒定與單孢純化，保存菌株14株，用于栗疫病藥劑敏感性試驗。試驗基礎培養基為馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（PSA）。

1.3 ?離體抑菌活性測定

采用菌絲生長速率法測定板栗疫病菌株對藥劑的敏感性。將用去離子水稀釋好的藥劑混入60 ℃以下未凝固的PSA培養基中，使藥劑在培養基中最終含藥量達到目標濃度（苯醚甲環唑的濃度梯度為0.150 0、0.100 0、0.075 0、0.050 0、0.037 5 μg/mL，氟硅唑的濃度梯度為0.600 0、0.300 0、0.150 0、0.075 0、0.037 5 μg/mL），倒平板。從在PSA平板上培養7 d的菌株菌落邊緣取直徑為5 mm的菌絲塊接種于含藥平板中心處，每個處理設3次重復。于25 ℃培養7 d后，用十字交叉法取菌落直徑（mm），取平均值再減去原菌塊直徑（5 mm）后，計算抑制率。試驗設2次重復。采用幾率值法，通過濃度對數值（x）和抑制率機率值（y）之間的線性回歸關系計算化學藥劑對板栗疫病各菌株的抑制中濃度（EC50）。endprint

抑制率=■×100%

1.4 ?不同敏感性菌株的菌絲生長速率

將不同敏感性菌株在PSA平板上培養7 d，用直徑為5 mm的打孔器取菌落邊緣打出菌餅轉到PSA平板上，25 ℃培養，培養7 d時測量各菌株的菌落直徑，比較不同敏感性菌株之間的菌絲生長速率。試驗重復3次。

1.5 ?不同敏感性菌株致病力差異

將不同敏感性菌株在PSA平板上培養7 d，取5 mm菌餅，在離體板栗葉片上用接種針刺傷，傷口避開葉片主脈，將每一菌株和無菌PSA塊（CK）分別接種于以上處理的離體葉片正面，接種后的葉片放入托盤內（盤底鋪上無菌濕紗布），盤口覆上保鮮膜，于25 ℃培養，培養3 d后記錄發病率和病斑直徑。試驗重復3次。

1.6 ?抗性菌株遺傳穩定性測定

將抗性較強的菌株于直徑為90 mm的無藥平板上培養至長滿培養皿，在菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅再接種至無藥平板上，視為轉接1代，連續轉接10代。采用菌絲生長速率法分別測定各菌株的第0代、第5代和第10代對藥劑的敏感性，并計算其抗性指數EC50，評估抗性菌株在轉代過程中的抗性遺傳穩定性。

1.7 ?數據處理

采用DPS 7.0.2數據統計軟件進行EC50計算和差異顯著性分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?栗疫病菌對苯醚甲環唑的敏感性檢測

采用菌絲生長速率法測定14株栗疫病菌株對苯醚甲環唑的敏感性，EC50結果見表1，栗疫病菌株的EC50范圍為0.027 9～0.124 0 μg/mL，平均為0.064 5 μg/mL，其中，菌株CRY-3的EC50最大，約是平均值的2倍，菌株B-4-3的EC50最小，菌株CRY-3和B-4-3在含有不同濃度苯醚甲環唑PDA培養基上菌落生長特征見圖1。

2.2 ?栗疫病菌對氟硅唑的敏感性檢測

采用菌絲生長速率法測定14株栗疫病菌株對氟硅唑的敏感性，EC50見表2，栗疫病菌株的EC50為0.024 6～0.218 6 μg/mL，平均為0.072 5 μg/mL，其中菌株3-1-1的EC50最大，是平均值的3倍，而菌株B-4-3的EC50最小，菌株CRY-3和B-4-3在含有不同濃度苯醚甲環唑PDA培養基上菌落生長特征見圖2。

2.3 ?不同敏感性菌株的適生性測定

2.3.1 ?不同敏感性菌株菌絲生長速率的比較 ?將對苯醚甲環唑抗性較強的菌株CRY-3、對氟硅唑抗性較強的菌株3-1-1和對兩種藥劑抗性較差的菌株B-4-3分別接種在PSA培養基上，培養7 d后比較菌落生長速率，菌株B-4-3菌絲較為稀疏，生長速率顯著低于其他兩個菌株，結果見表3。

2.3.2 ?不同敏感性菌株的致病力差異 ?將菌株CRY-3、3-1-1和B-4-3分別接種到板栗品種金栗王葉片，比較接種3 d后板栗葉片的發病率和病斑直徑，結果見表3。菌株B-4-3的發病率和病斑直徑均顯著低于其他2個菌株。

2.3.3 ?抗性遺傳穩定性 ?對菌株CRY-3和菌株3-1-1分別進行繼代培養后，比較菌株的第0代、第5代和第10代對藥劑的敏感水平，結果見表4和表5。菌株CRY-3和菌株3-1-1在第5、10代時的EC50無顯著變化。

3 ?小結與討論

2種化學殺菌劑對板栗疫病均表現出較好的抑制效果，14個菌株對2種化學藥劑菌表現出較大的敏感性差異，表明同一地區不同菌株敏感性差異較大。苯醚甲環唑和氟硅唑同屬于三唑類化學藥劑，試驗中14個菌株對苯醚甲環唑和氟硅唑的EC50平均值無明顯差異，而單個菌株對2種藥劑的EC50存在一定差異，菌株B-4-3對2種藥劑均表現出敏感性。試驗中表現出對藥劑抗性較強的菌株CRY-3和3-1-1菌絲生長速率快、致病力強，研究中還發現2株抗性較強的菌株菌絲生長旺盛、菌落厚、產孢慢，而抗性較弱的菌株B-4-3菌絲生長量較少、產孢量大，可能是菌落生長特性與菌株致病力和抗藥性分化存在一定的相關性。

多種化學殺菌劑和用藥方式被嘗試應用于栗疫病的防治[12，13]，研究表明內吸性化學藥劑對栗疫病有較好的防治作用。化學防治在栗疫病的防治上應用較難，早期的化學殺菌劑使用劑量大且使用方法不當，容易產生藥害。本試驗所用三唑類化學殺菌劑具內吸性、用量少等優點，室內試驗結果表明，2種殺菌劑對栗疫病菌有較好的防治效果，該類藥劑在板栗疫病防治中具有較大的應用潛力，應用于田間栗疫病防治并配合改進使用方法還有待進一步研究。

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