曬煙種質資源形態學標記及SSR標記的多樣性分析

王慧穎+王曼+樸世領+金愛蘭+陳爽

摘要： 以吉林省常見的23份曬煙和2份烤煙為試材，利用形態學標記和SSR分子標記兩種方法進行遺傳距離的研究，并將所得的遺傳距離進行相關性分析。結果表明，曬煙材料的形態學歐氏距離在1.11～8.29之間，歐氏距離較小，說明各曬煙品種間遺傳基礎狹窄。通過SSR標記法，得到各曬煙材料間的遺傳背景較相似，遺傳相似系數為0.51～0.98，相似性較大，說明親緣關系較近。兩種方法的聚類分析結果基本一致。利用SPSS軟件對形態學歐氏距離與SSR遺傳相似系數進行了相關性分析，結果呈極顯著負相關，相關系數為r=-0.383。由此可見，分子標記能反映煙草品種間的遺傳變異，通過這種簡便快捷的標記方法，能夠提高煙草育種效率。

關鍵詞：曬煙;形態學標記;SSR標記;親緣關系;遺傳多樣性;相關性分析

中圖分類號：S572 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）23-5943-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.038

The Genetic Diversity Analyses on Sun-cured Tobacco Germplasm by Morphological Markers and SSR Markers

WANG Hui-ying1， WANG Man1， PIAO Shi-ling1， JIN Ai-lan2， CHEN Shuang1

（1.Agricultural College，Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China;2.Yanbian Academy of Agricultural Sciences，Longjing 133400，Jilin，China）

Abstract： Taking 23 common sun-cured tobaccos and 2 flue-cured tobaccosof Jilin province as test materials， combining with morphological markers and SSR markers， the correlation of genetic distance was analyzed. Results showed that， morphology euclidean distance of sun-cured material was 1.11～8.29， which showed genetic base among sun-cured tobacco varieties was relatively narrow. Genetic backgrounds between each sun-cured materials were similar through SSR markers， the genetic similarity coefficient was 0.51～0.98. Cluster analysis results of the two methods were basically the same. The correlation analysis between morphology euclidean distance and SSR genetic similarity coefficient was conducted by SPSS software， a significant negative correlation was obtained with correlation coefficient ?r=-0.383. It was concluded ?that molecular markers could reflect the genetic variation among breeds， andimprove the breeding efficiency.

Key words：sun-cured tobacco;morphological markers;SSR markers;genetic relationship; genetic diversity;correlation analysis

吉林省曬煙作為中國名曬煙之一，以色澤鮮明、吃味純凈、油分充足、香氣優雅濃郁、焦油釋放量低等特點在中國享有很高的聲譽[1]。但后來盲目追求產量、忽視質量、科研投入少，沒有開展深層次的科學研究，致使種質間遺傳基礎狹窄，煙葉內在質量差，生產規模萎縮[2]，阻礙了煙草產量和質量的進一步提高[3]。加之長久以來，種煙戶自由種植，導致優質品種逐漸退化，出現品種混雜現象，嚴重影響了吉林省曬煙聲譽，挫傷了煙農種煙積極性。為此，探索種質資源之間的遺傳多樣性和建立核心種質資源庫非常必要。

形態標記為一種操作簡單、直觀、便于觀察的遺傳標記，是人們最早利用的遺傳標記[4]。牛佩蘭等[5]、肖炳光等[6]先后利用形態學標記對遺傳距離進行測定和聚類分析，證明了形態學標記遺傳多樣性的可行性。SSR（Simple Sequence Repeat，簡單序列重復）標記是建立在 PCR 技術上的 DNA標記，其操作相對簡單、獲得結果快速且不受試驗環境條件的影響。陳杰[4]再次證明了SSR分子標記技術對遺傳多樣性研究的結果具有較高的準確度，能很好地揭示其親緣關系。目前，SSR分子標記技術已被廣泛用于烤煙種質資源遺傳多樣性檢測、品種鑒定和親緣關系的研究[7]，但針對吉林省特定生態區域曬煙的研究甚少。為此，本研究利用形態學標記和SSR分子標記對曬煙種質資源進行了遺傳多樣性分析，以期為吉林省曬煙種質資源的合理利用和優良新品種的選育提供一定的依據。endprint

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

以吉林省常見的23份曬煙（1～23號）和2份烤煙（24～25號）品種為試驗材料。品種及編號：①五十葉、②紅花鐵矮子、③光興煙、④牡丹池煙、⑤吉林琥珀香、⑥元峰煙、⑦小馬稀、⑧大馬稀、⑨風林一號、⑩紅花矮子、■孟山草、■大護耳柳葉尖、■仲成五十葉、■杰滿煙、■延曬一號、■延曬二號、■“8107”、 18延吉自來紅、 19延吉千層塔、 ?20太興煙、

21延邊紅、 22牡丹一號、 ?23松川（關東201）、 ?24云煙87、25吉煙九號。供試材料種子取自吉林省延邊朝鮮族自治州農業科學院煙草研究所。所有煙草材料種植于延邊大學農學院煙草試驗基地，每個品種種植60株。

1.2 ?試劑和儀器

植物基因組DNA提取試劑盒購自南京奧多福尼生物科技有限公司;10×buffer、Marker、25 mmol/L Mg2+、Taq酶、dNTP和瓊脂糖凝膠均購自大連寶生物工程有限公司;試驗采用Bindler等[8]發表的引物序列，由上海生物工程技術服務有限公司合成。引物用滅菌雙蒸水稀釋成10 pmol/μL備用。

DYY-12型電泳儀、電泳槽（北京六一儀器廠）;PCR梯度擴增儀、全自動凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad公司）;LX—100手掌型離心機（海門市麒麟醫用儀器廠）;水浴鍋;臺式離心機（合肥名威科技發展有限公司）;Sanyo MDF-U73V型超低溫冰箱（上海旦鼎國際貿易有限公司）等。

1.3 ?試驗方法

1.3.1 ?各品種煙葉的形態學性狀指標分析

1）煙葉農藝性狀的測定。分別測定各品種的株高、莖圍、葉數、節距、葉長、葉寬（每品種定10株記載植物學性狀，求平均值），并觀察不同品種的株型、葉形、葉色和花色。具體參照中華人民共和國煙草行業標準（YC/T 142-2010）進行。

2）煙葉主要化學成分的測定。打頂后10 d，選取有代表性的煙株3株，分別取上部、中部、下部新鮮葉片若干作為測定材料，取樣后用液氮保存并迅速送實驗室進行殺青30 min，然后烘干、研碎過篩，裝入塑料袋中做好標簽密封，保存備用。分別測定總糖、還原糖[9]、煙堿[10]、總氮[11]和蛋白質含量[10]，形態學性狀的統計每份材料的每個性狀重復測定3次。

1.3.2 ?SSR-PCR反應體系及檢測方法

采用植物基因組DNA試劑盒提取法提取DNA。曬煙的SSR-PCR反應體系為：20 μL體系中含10×PCR buffer 2 μL，模板DNA 20 ng，引物0.25 μmol/L，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq酶1.5 U，ddH2O 10.1 μL。PCR反應條件為預變性：95℃ 5min;95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s（視引物而變），72 ℃ 50 s，40個循環;72 ℃延伸5 min，4 ℃保存備用[12]。

取不同品種的PCR擴增產物15 μL分別與3 μL溴酚藍混勻，依次點入2%瓊脂糖凝膠膠口中，電泳后用EB染色，然后在美國BIO-RAD全自動凝膠成像儀上照相觀察。

1.3.3 ?數據處理與統計分析

利用SPSS軟件對25份供試材料的6個農藝性狀和5種化學成分指標進行標準化處理，然后按歐氏距離、離差平方和法進行系統聚類分析[13]，并繪制樹狀圖。對于SSR帶型，在相同遷移率的位置上，對每個位點上的條帶進行計數，有帶記為“1”，無帶記為“0”。數據分析采用NTSYS2.10軟件，聚類分析用類平均法UPGMA（Un weighted pair-Group Method with Arithmetic mean）程序進行，首先計算出任意兩個材料間的遺傳相似系數，然后獲得相應的遺傳樹狀圖[14]。將表型性狀獲得的遺傳距離矩陣與SSR分析獲得的遺傳相似系數矩陣數據輸入SPSS軟件，對二者進行形態學歐氏距離與SSR遺傳相似系數的相關性分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?形態學標記結果與聚類分析

25份品種間的歐氏距離列于表1，歐式距離越大，遺傳差異性越大。試驗結果表明，兩份烤煙材料與曬煙各品種間的歐氏距離均較大，介于7.44～10.58之間，說明不同煙草類型間的遺傳差異性較大，其中烤煙云煙87與曬煙吉林琥珀香的遺傳差異性最大，歐式距離為10.58;兩份烤煙之間的歐氏距離僅為0.87，說明二者在25份供試材料中的親緣關系最近;23份曬煙之間的歐氏距離以延吉自來紅和延吉千層塔最小，為1.11，說明二者在23份供試曬煙中的親緣關系最密切，而親緣關系最遠的兩份曬煙是牡丹池煙和“8107”，歐氏距離為8.29。

由形態學指標樹狀圖（圖1）可知，烤煙與曬煙間的遺傳相似性較低，當歐氏距離取值為11時，可以明顯地將它們區分成兩大類，即Ⅰ1和Ⅰ2，當歐氏距離取值為8時，可將所有的曬煙系列（Ⅰ2）進一步分成兩個亞類（Ⅱ1、Ⅱ2）。第一亞類（Ⅱ1）包括延吉自來紅、延吉千層塔、仲城五十葉、吉林琥珀香、紅花矮子以及孟山草，第二亞類（Ⅱ2）包括其他的17份曬煙品種，總體來看，供試曬煙品種間的遺傳基礎較為狹窄。

2.2 ?SSR的遺傳多樣性分析

用已篩選出的10對SSR引物對所有供試品種進行PCR擴增，在分子量為200～1 000 bp范圍內，10對引物在25份供試材料中共擴增出52條帶，其中有44條帶是多態性條帶，占總帶數85%，表明不同供試種質之間遺傳多態性豐富，另外8條是所有品種共有的條帶，這在一定程度上揭示了各煙草種質間的同源性，同時也證實了SSR分子標記法用于煙草品種親緣關系分析的可靠性。圖2為引物PT20306對所有供試品種的擴增結果。endprint

2.3 ?25份供試品種間的遺傳相似系數及聚類分析

利用NYSTS軟件對所有供試品種之間的遺傳相似系數進行了統計（表2）。結果表明，相似性系數越大，親緣關系越近。23份供試曬煙的遺傳相似系數介于0.531～0.980之間，平均相似系數為0.744，說明供試曬煙間的遺傳相似性較大，親緣關系較近，其中吉林琥珀香、元峰煙和小馬稀三者之間表現最明顯，而松川（關東201）雖為日本引進種質資源，但它與其他地方性曬煙種質的遺傳相似性較高，在雜交方面并不具備優勢，23份曬煙種質與供試烤煙間的遺傳相似性系數平均值為0.627，親緣關系相對較遠，其中表現最明顯的是紅花鐵矮子、延曬二號與云煙87之間，可能是不同煙屬和不同地區栽培環境造成的，而云煙87與吉煙九號同屬于烤煙，因此遺傳關系相對較近，相似系數為0.857。

為了更直觀地看出25個供試品種在基因組上的遺傳關系，利用UPGMA法對所有供試品種的遺傳相似系數矩陣進行聚類分析，構建了不同煙草品種間的樹狀圖（圖3）。試驗表明，兩份烤煙與其他曬煙在第一等級劃分時就被明顯的劃分成兩大類群（Ⅰ1、Ⅰ2），它們間的遺傳相似性最小，僅為0.628，第二等級劃分（L2=0.690）可以將Ⅰ2進一步劃分為兩大亞類。

第一亞類（Ⅱ1）包括9個品種，分別為紅花矮子、仲成五十葉、太興煙、孟山草、牡丹一號、松川（關東201）、延曬一號、8107、延邊紅，組內遺傳相似系數介于0.698～0.898之間。

第二亞類（Ⅱ2）包括14個曬煙品種，即五十葉、紅花鐵矮子、杰滿煙、吉林琥珀香、元峰煙、小馬稀、風林一號、大護耳柳葉尖、延曬二號、延吉千層塔、大馬稀、光興煙、延吉自來紅、牡丹池煙，組內遺傳相似系數為0.726～0.980之間。

第三等級劃分（L3=0.7），可在第二等級劃分結果不變的情況下再將第一亞類（Ⅱ1）劃分成兩個小亞類，即Ⅲ1、Ⅲ2，其中Ⅲ1包括紅花矮子、仲成五十葉、太興煙、孟山草、牡丹一號和松川（關東201），Ⅲ2包括其他3份曬煙延曬一號、“8107”和延邊紅。

由此可見，兩份烤煙與其他曬煙品種之間有較好的分辨能力，較早地就形成了兩個不同的分支，而曬煙種內遺傳基礎相對狹窄，尤其是吉林琥珀香與元峰煙之間的遺傳相似性最大。

2.4 ?形態學歐氏距離與SSR遺傳相似系數的相關性分析

為了檢測同組供試材料基于形態學標記和SSR分子標記分析結果的相關程度，本研究利用SPSS軟件對形態學歐氏距離與SSR遺傳相似系數進行了相關性分析，結果呈極顯著負相關，相關系數為r=-0.383，為進一步探討形態學歐氏距離與SSR遺傳相似系數確定不同品種遺傳差異的一致性程度，又將化學成分組合和農藝性狀組合所得到的歐氏距離分別與SSR分析得到的遺傳相似系數進行相關分析，結果均表現為極顯著負相關，其相關系數分別為r=-0.366和r=-0.265。

3 ?小結與討論

從形態學標記和SSR分子標記分析比較來看，兩者結果總體上一致，但存在一定的差異。兩種方法均說明了供試曬煙品種間遺傳相似性較大、遺傳基礎狹窄，經相關性檢測，形態學歐氏距離與SSR遺傳相似系數呈極顯著負相關，相關系數為 ? ? r=-0.383。這不僅說明SSR分子標記應用于煙草遺傳關系分析的可靠性，也反映了本研究所選用的形態學標記法在品種資源鑒定中的合理性。這一點在朱慧麗[15]的研究中也有所體現，但相關性結果與本試驗稍有不同，可能是由于供試煙草類型不同、分子標記方法亦不同引起的。與SSR聚類結果相比，形態學標記稍有不同，如延曬一號和延曬二號是兩個遺傳背景不同的品種，在SSR標記中得到了證實，但形態學標記并未將它們區分開，又如吉林琥珀香和元峰煙在形態學標記中是被分到兩個不同的曬煙大亞類中，但在SSR標記中，它們卻是最先被聚成一類的，親緣關系最近。造成這種差異的原因可能是形態學標記受環境和人們主觀因素影響較大。實際上，形態學差異和分子水平的差異所經受的進化壓力不同，遵循的規律也不同，彼此是相互獨立的[16]，形態學上的差異并不一定是DNA水平變異的真實反映[17]，換句話說，肉眼可觀察到的形態學性狀的差異在SSR標記檢測的多態性位點上并不一定都能表現出來。為此，可以有針對性地設計引物，使之覆蓋面廣，將形態學性狀上表現差異的位點都以SSR等位位點的形式檢測出來，最終達到兩種標記的協同統一。

綜上所述，SSR標記法更利于育種工作者進行早期鑒定，明確各品種遺傳關系，從而縮短育種年限，加快育種步伐，提高育種效果，且該標記方法更符合植物學分類的結果。總而言之，SSR分子標記法是比形態學標記更優的遺傳多樣性分析方法。

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