六株湖北省ALV—J地方分離株的gp85基因序列分析

汪宏才+羅青平+溫國元+張騰飛+楊峻+艾地云

摘要：通過對ALV-J病毒gp85基因進行分析，發現6個湖北分離株與國際標準的肉雞分離毒株HPRS103株核苷酸序列相似性為93.9%～98.2%，氨基酸序列相似性為88.8%～97.8%。其中HuB09XZ01株、HuB09JY03株、HuB09JY04株與HPRS103株核苷酸序列相似性達到98.1%～98.2%，氨基酸序列相似性達到97.4%～97.8%。系統遺傳進化表明，湖北分離株HuB09XZ01株、HuB09JY03株、HuB09JY04株與ALV-J國際標準毒株HPRS103遺傳距離最近。通過分析表明，湖北省ALV-J主要來源于肉雞，大都通過引種感染，這對于湖北省禽白血病的凈化以及家禽品種的選育具有重要參考意義。

關鍵詞：禽白血病;J亞群;相似性;進化樹

中圖分類號：S858.31 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）23-5956-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.041

Analysis of gp85 Gene Sequences of 6 ALV-J isolates in Hubei Province

WANG Hong-cai， LUO Qing-ping， WEN Guo-yuan， ZHANG Teng-fei， YANG Jun， AI Di-yun

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Sciences/Hubei Key Laboratory ?of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

Abstract： Through the analysis of gp85 gene of ALV-J virus，the nucleotide sequences of 6 strains isolated from Hubei show 93.9%～98.2% similarity to the international standard strainHPRS103 isolated from broiler，the similarity of amino acid sequences range between in 88.8%～97.8%. Hereinto，The similarity of nucleotide sequence and ?amino acid sequence between strains HuB09XZ01，HuB09JY03，HuB09JY04 and ?the international standard strain HPRS103 reached 98.1%～98.2% and97.4%～97.8% respectively.Phylogenetic tree showed that，Hubei isolates HuB09XZ01，HuB09JY03and HuB09JY04 were close to HPRS103.These results suggested that ALV-J in Hubei province mainly comes ?from broiler，and has the reference significance to poultry breeding ?in our province.

Key words：avian leukosis;subgroup J;sequence similarity;phylogenetic tree

禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的一種傳染性腫瘤病。1908年首次報道，至今該病已在許多國家發生和流行。中國最早是在肉雞群中發現此病例，近年來，蛋雞和地方雞的病例也時有報道，發病呈上升趨勢[1]。ALV可分為A～J共10個亞群，其中只有A、B、C、D、E和J亞群能感染雞。致病性ALV以A、B和J 這3 種亞群為主，也是目前中國雞群中流行最為廣泛的3個外源性病毒亞群[2]。自2008年以來，ALV-J誘發的腫瘤/血管瘤在蛋雞中形成了流行趨勢。隨后，地方雞群檢出率明顯增加，這對禽白血病的防控帶來嚴重的挑戰。ALV-J前病毒基因組具有典型的C型反轉錄病毒基因組結構，即5LTR-5UTR-gag-pol- env-3UTR-3LTR。由于env基因變化大，與其他ALV env相似性低，且與致瘤性密切相關，并決定病毒感染的宿主范圍。env基因編碼2種病毒囊膜蛋白，即gp85蛋白和gp37蛋白。gp85蛋白含有病毒受體決定簇，決定亞群特異性和宿主范圍[3]。通過對已公開發表的6株ALV-J湖北地方分離株gp85基因進行了分析，重點研究ALV-J病毒gp85基因的同源性，分析ALV-J流行株分子演化過程，為湖北省禽白血病的防治和凈化提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?禽白血病參考株

選取湖北省ALV-J亞群6個地方分離株（HuB09-1株、HuB09XZ01株、HuB09WH02株、HuB09WH03株、HuB09JY03株、HuB09JY04株）[4， 5]、國內其他地區ALV-J亞群參考株8株（JS09GY3株、WN100402株、HLJ13SH01株、JL093-1株、SD09DP03株、GD1109株、SX090915J株、HB09-1株），以及ALV-J國際原型毒株HPRS103株。登錄Genbank查詢各參考毒株的核苷酸和氨基酸序列。15株ALV-J病毒Genbank名稱、登錄號、分離時間以及分離地點見表1。endprint

1.2 ?對15株ALV-J gp85基因核苷酸及氨基酸序列進行分析比較

應用ClustalX、DNASTAR以及MEGA等軟件，對15株ALV-J參考株的gp85基因核苷酸序列和氨基酸序列進行比對，分析6個ALV-J湖北分離株與其它參考毒株間的相似性，并分別依據gp85基因的核苷酸序列和氨基酸序列建立系統進化圖譜，進一步分析其進化親緣關系。

2 ?結果與分析

2.1 ?15株ALV-J病毒gp85基因核苷酸序列和氨基酸序列分析結果

15株ALV-J病毒gp85基因核苷酸序列相似性比較見圖1，氨基酸序列相似性見圖2。通過對15株ALV-J gp85基因的核苷酸序列進行比對分析，15株參考株的核苷酸序列相似性在93.0%～99.9%，氨基酸序列相似性在88.1%～99.6%。6個湖北分離株與國際原型毒株HPRS103株核苷酸序列相似性在93.9%～98.2%，氨基酸序列相似性在88.8%～97.8%。其中HuB09XZ01株、HuB09JY03株、HuB09JY04株與HPRS103株核苷酸相似性達到98.1%～98.2%，氨基酸序列相似性達到97.4%～97.8%。HuB09WH02株、HuB09WH03株與JS09GY3株核苷酸同源相似性在98.8%～99.2%，氨基酸相似性在97.3%～98.7%。HuB09-1株則與HLJ13SH01株、JL093-1株、SD09DP03株相似性較高。

2.2 ?15株ALV-J病毒系統發育樹

對15株ALV-J gp85基因的核苷酸序列和氨基酸序列分別制作系統發育圖譜，ALV-J病毒核苷酸序列系統發育樹見圖3，蛋白質序列系統發育樹見圖4。

兩種方法制作的系統發育樹顯示，15株參考毒株分屬兩個大的分枝，湖北分離株HuB09XZ01株、HuB09JY03株、HuB09JY04株與國際ALV-J原型株HPRS103遺傳距離最近，這與潘偉等[6]對HuB09JY03株分析結果相似。而HuB09WH03株、HuB09WH02株與JS09GY3株遺傳距離最近，HuB09-1株和SX090915J株、HB09-1株同屬一組分枝。

3 ?討論

通過對ALV-J病毒gp85基因的核苷酸和氨基酸序列進行對比分析，兩種分析方法所得結果基本一致。

ALV-J屬于種源性疾病，防治十分困難。2009年，J亞群白血病在華中局部地區蛋雞場大面積流行，發病率最高達到46%[7]。據彭伏虎等[8]的調查結果發現，由于湖北省缺乏相應品種的祖代場，種蛋和雞苗主要從外地引進，種源質量難以控制。本地品種雞在選育過程中，為了提高生產性能，常引進外來血液，也會造成ALV-J的傳播。因此，引種是造成ALV-J傳播的主要原因。

通過分析表明，湖北分離株主要位于進化樹2個分支，說明在湖北地區ALV-J流行毒株存在多樣性。HuB09XZ01株、HuB09JY03株、HuB09JY04株與國際ALV-J原型株HPRS103同屬一個分支，遺傳距離近，說明湖北地區ALV-J病毒可能來源于肉雞。ALV-J最早由英國Payne于1988年從肉雞中分離得到，1999年國內由杜巖等首次分離和鑒定到ALV-J。目前J亞群禽白血病在我國各地廣泛存在，而且該亞群病毒有很廣的宿主范圍，導致禽群死淘率明顯升高，生產性能降低等，已成為危害中國養禽業最嚴重的疾病之一[9]。

在中國，ALV-J不僅隨著引進的白羽肉種雞帶進了我國白羽肉雞群，還進一步蔓延至我國的蛋雞和中國地方雞種。這不僅給中國規模養雞業帶來很大損失，也威脅到地方雞品種的種質基因庫。隨著地方雞產業的發展，人們正在對地方雞進行品種改良。湖北地方雞品種較多，現已有不同程度的感染。因此，在引進外來血液的過程中，需要嚴格對ALV進行檢測，防止地方雞核心群受到ALV-J的感染。

禽白血病傳播的途徑主要有種蛋垂直傳播、疫苗污染等。因此對引進的父母代以上的種蛋、雞苗，在引種前需對ALV-J進行評估，以免造成重大經濟損失。疫苗應選擇正規廠家的產品，減少因接種而引起的病毒傳播。

由于禽白血病病毒容易產生變異，且目前尚無有效的藥物進行控制，因此，減少禽白血病的發生主要通過凈化淘汰的方法。尤其是種雞場，根據ALV的增殖規律，需要進行3～4個世代的凈化，降低ALV的陽性率。由于ALV易產生變異，構筑生物安全措施勢在必行。

參考文獻：

[1] 俞 ?燕，朱鴻媛，高明燕，等.地方雞種禽白血病病毒感染動態及檢測方法比較[J].中國家禽，2014（8）：23-26.

[2] 毛婭卿，李衛華，董 ?宣，等.差異極大的不同準種隱藏于同一J亞型禽白血病病毒野毒株中[J].中國科學：生命科學，2013（6）：492-498.

[3] 潘 ?偉.蛋雞J亞群禽白血病分子流行病學調查及致病性研究[D].北京：中國農業科學院，2011.

[4] PAN W， GAO Y， QIN L， et al. Genetic diversity and phylogenetic analysis of glycoprotein GP85 of ALV-J isolates from Mainland China between 1999 and 2010： coexistence of two extremely ?different subgroups in layers[J]. Vet Microbiol， 2012，156（1-2）：205-212.

[5] GAO Y， YUN B， QIN L， et al. Molecular epidemiology of avian leukosis virus subgroup J in layer flocks in China[J]. J Clin Microbiol，2012，50（3）：953-960.

[6] 潘 ?偉，高玉龍，孫芬芬，等.蛋雞J亞群禽白血病病毒HB09JY03株的分離鑒定及其全基因組序列分析[J].中國獸醫科學，2010（11）：1110-1114.

[7] 羅青平，張蓉蓉，邵璐璐，等.2009年湖北省雞J亞群白血病的初步調查分析[J].中國家禽，2010（16）：63-65.

[8] 彭伏虎，宋念華，陶淑珍，等.蛋雞J亞群禽白血病的流行病學調查[J].中國畜牧獸醫，2010，37（8）：203-206.

[9] 張小桃，賴漢漳，曹偉勝.禽白血病病毒檢測方法研究進展[J]. 養禽與禽病防治，2009（4）：4-6.endprint