輻照對中華絨螯蟹過敏蛋白生化特性的影響

廖濤+楊鍇+耿勝榮+熊光權+陳玉霞+李新+鉏曉艷+白嬋+程薇

摘要：為研究輻照脫除中華絨螯蟹過敏性的效果，對中華絨螯蟹的過敏原粗提液輻照0～45 kGy后進行SDS-PAGE、熒光光譜、紫外光譜分析和免疫印跡鑒定，研究輻照對過敏蛋白濃度、濁度、疏水性、免疫原性的影響。結果表明，與未輻照的中華絨螯蟹過敏原相比，輻照后蛋白濃度降低，濁度增高，從3 kGy時濁度的變化與蛋白濃度變化呈正相關，隨蛋白濃度增高或降低，濁度也逐漸增加或減少。從低劑量到高劑量輻照時，疏水性逐漸增強，到20 kGy時疏水性達到最大值，然后隨著輻照劑量的增加疏水性降低。低劑量輻照時過敏蛋白的濃度變化不大，到20 kGy時，過敏蛋白含量明顯降低;45 kGy時，過敏蛋白基本被完全降解。免疫印跡試驗結果表明，過敏蛋白的免疫原性隨著輻照劑量的增加而降低。

關鍵詞：中華絨螯蟹;過敏原;輻照;生化特性

中圖分類號：S981.22 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）23-5973-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.046

Effects of Irradiation on Bio-chemistry Properties of Allergen in Chinese Mitten Crab

LIAO Tao，YANG Kai，GENG Sheng-rong，XIONG Guang-quan，CHEN Yu-xia，LI Xin，

ZU Xiao-yan，BAI Chan， CHENG Wei

（ Institute of Agro-Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Engineering Research Center for Farm Products Irradiation，Wuhan 430064，China）

Abstract： The effects of irradiation reducing allergenicity of Chinese Mitten Crab （Eriocheir Sinensis） were studied by SDS-PAGE， Fluorescence Spectrum， Ultraviolet Spectrum technology and Western-Blotting were used to analyze the change of allergy protein concentration， turbidity， surface hydrophobicity and immunogenicity after irradiated among 0～45 kGy dosage. The results showed that protein concentrations decreased compared with the unirradiated Chinese mitten crab allergen， turbidity changes were positively related to protein concentrations， and turbidity also gradually increased or decreased when the protein concentrations increased or decreased. From low dose to high dose irradiation， the surface hydrophobicity gradually increased and reached the maximum value at 20 kGy， however surface hydrophobicity reduced from 20～ 45 kGy. The electrophoretogram of SDS-PAGE showed that allergic protein concentration had a slight change at low dose irradiation， siginificantly decreased at 20 kGy， and the allergic protein was completely degraded when the dose reached 45 kGy. The results of Western-Blotting indicated that allergic protein immunogenicity reduced with the increase of irradiation dose.

Key words：Chinese mitten crab; allergen; irradiation; bio-chemistry properties

食物過敏，也稱為食物變態反應、消化系統變態反應、過敏性胃腸炎等，是由于進食某種食物后造成的不良反應，有嘔吐、腹瀉及皮膚起皰等癥狀，嚴重的食物過敏能引起窒息、急性哮喘、過敏性休克甚至死亡。在聯合國糧農組織提出的八大類易過敏食物中，蝦蟹等甲殼類水產品是最重要的一類[1-3]。中華絨螯蟹又稱河蟹、毛蟹、清水蟹、大閘蟹或螃蟹，味道鮮美，營養豐富，是一種經濟蟹類，是中國傳統的名貴水產品之一。隨著消費人群的擴大，隨之而來的蟹類過敏報道屢見不鮮[4-7]。

食品輻照是20世紀發展起來的一種專門用于食品類的滅菌保鮮技術，輻照可使蛋白質等生物大分子發生解聚、交聯、裂解以及空間結構、構象的改變。繼而抗原決定簇遭到破壞，過敏蛋白原有免疫原性喪失。機體的免疫細胞接收不到足夠的生物信息或無法識別抗原分子不能引發機體的免疫應答，從而免疫發生過敏反應引起疾病[8]。目前，輻照脫敏在蝦[9-11]、花生[12，13]、紅豆[14]等過敏食品上開展了大量研究，認為輻照改變了蛋白質的二級結構，使蛋白質分子展開，疏水基團暴露，形成多聚體，從而抗原性下降[15]。但有關中華絨螯蟹過敏原組成及輻照脫敏效果鮮見報道。因此，研究輻照降低中華絨螯蟹過敏原過敏性對保護消費者食品安全有著積極的意義。endprint

本試驗對中華絨螯蟹組織蛋白中引起食物過敏癥的主要過敏原進行初步提取和免疫學活性分析，并對其進行輻照處理，從而觀察其物理化學性質的變化，為進一步研制蟹類食物過敏癥的檢測試劑和脫敏制劑提供依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料與試劑

鮮活的中華絨螯蟹在中百倉儲購買，蟹過敏患者特異性血清由同濟醫院變態反應科提供。

主要試劑：丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉、甘氨酸、N，N，N′，N′-四甲基二乙胺、酶標二抗、牛血清蛋白、8-苯氨基-1-萘磺酸（ANS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二氨基聯苯胺（DAB）、溴酚蘭、考馬斯亮蘭R-250、考馬斯亮藍G-250、巰基乙醇、麗春紅等，均為分析純及生物純。

1.2 ?試驗儀器

儀器：鈷-60輻射源（裝源量30萬居里），湖北輻照實驗中心;熒光分光光度計（F93），上海棱光技術有限公司;熒光檢測器（RF-20A）、紫外分光光度計（TU-1810PC），北京普析通用儀器有限責任公司;電泳儀（DYY-6C型、DYCZ-24D型）、轉移芯（DYCZ-40D型），均為北京市六一儀器廠產品;高速冷凍離心機（SPX-Ⅱ），湖南湘儀離心機儀器公司。

1.3 ?樣品處理

1.3.1 ?蟹肉粗提液的制備 ?根據參考文獻[16]進行蟹肉粗提液制備，略有改進。中華絨螯蟹去殼取肌肉，稱取一定量的肌肉，剁碎，置于干凈燒杯中，加入4倍體積的冷丙酮（-20 ℃預冷過夜），攪拌1 min，置于4 ℃冰箱中靜置30 min，棄去丙酮，再加入4倍體積的冷丙酮，攪拌1 min，置于4 ℃冰箱中靜置30 min，棄去丙酮，再重復丙酮操作一次，棄去丙酮后，將燒杯置于通風處使丙酮揮發，待丙酮揮發完后，加入2倍體積的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，攪拌30 min后，置于4 ℃冰箱中過夜。第二天將其取出，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，上清液即為蛋白粗提液。

1.3.2 ?輻照處理 ?取27個10 mL透明塑料離心管，每管裝6 mL蛋白粗提液，每3個一組，分為9組，進行室溫輻照，輻照劑量為0、3、6、9、12、15、20、30、45 kGy，對其進行編號，編號與輻照劑量相同。實際吸收劑量以硫酸亞鐵劑量來跟蹤，分別編號。

1.4 ?測定方法

1.4.1 ?輻照后中華絨螯蟹過敏蛋白濃度、濁度變化 ?參照顧可飛等[17]的操作方法略作改進。濁度測定：輻照后各管吸取20 μL溶液，加入裝有2 mL考馬斯亮藍 G-250和180 μL去離子水的試管中，混勻后于 595 nm處測定其吸光度。過敏蛋白濃度測定：輻照后的過敏蛋白溶液于 280 nm下測定其吸光度。采用紫外分光光度計測定二者吸光度。

1.4.2 ?疏水性變化 ?參照顧可飛等[17]的操作方法。向2 mL輻照后的過敏蛋白溶液中加入15 μL的8-苯氨基-1-萘磺酸（ANS ）液，混勻，室溫放置2 h，激發波長為385 nm，進行發射波長在420～550 nm范圍內的熒光強度掃描。采用熒光光度計測定過敏蛋白的疏水性。

1.4.3 ?SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 ?將輻照后的過敏蛋白溶液50 μL與等體積的上樣緩沖液進行混合后，于沸水浴中煮沸3～5 min，分離膠濃度為15%，電泳電壓為100 V，濃縮膠濃度為4%，電泳電壓為60 V，待指示劑離開凝膠后停止電泳，將膠片取下后，放入考馬斯亮藍R-250中過夜染色，然后回收染色液，加入脫色液中脫色至背景無色。

1.4.4 ?中華絨螯蟹過敏原鑒定 ?利用15%的分離膠，5%的濃縮膠將過敏原蛋白質分離后，取出凝膠，與剪好的Whatman濾紙和硝酸纖維素膜一起放入蛋白轉印緩沖液中浸潤30 min，按（+）支持板-無紡纖維墊-兩層濾紙-硝酸纖維素膜-凝膠-兩層濾紙-無紡纖維墊-支持板（-）的順序安裝轉印芯，按紅（陽極）、黑（陰極）方向將其放入轉印槽中，倒入轉印緩沖液，在90 V下轉印2.5 h，取出硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜放入麗春紅中染色5 min，以確定蛋白質是否轉上去。確定轉上后，將染色的硝酸纖維素膜用去離子水漂洗，直至紅色褪去。洗干凈后的硝酸纖維素膜放入封閉液中4 ℃過夜，棄去封閉液，加入20倍稀釋（V/V）的一抗室溫反應2.0 h，TBST洗膜6次，每次5 min（6×5 min），洗完后加入1 000倍稀釋（V/V）的二抗室溫反應2.0 h，TBST洗膜6×5 min，洗完后加入新配置的DAB溶液顯色5 min，以水沖洗終止反應。

1.5 ?數據統計

用ANOVA 和Spjotvoll-Stoline test軟件對數據進行統計分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?中華絨螯蟹粗提液濃度

中華絨螯蟹粗提液595 nm處吸光度值以牛血清白蛋白為標樣，得到的標準曲線為Y=0.013 9X+1.141 4，R2=0.989 7，其中Y為吸光度，X為牛血清白蛋白含量（μg）。10 μL中華絨螯蟹粗提液樣品在595 nm處吸光度為1.283，根據公式計算得到中華絨螯蟹粗提液樣品的濃度為1.02 mg/mL。

2.2 ?中華絨螯蟹粗提蛋白組分

中華絨螯蟹組織蛋白經脫脂和PBS提取后，采用SDS-PAGE進行分離。中華絨螯蟹粗提液有12條可辨蛋白條帶，分子質量從18.6～89.1 kDa 不等，其中主要的蛋白條帶為18.6、20.1、23.4、27.1、37.2、41.7、43.1、47.9、53.7、67.6、75.9和 89.1 kDa（圖1）。endprint

2.3 ?中華絨螯蟹蛋白組分過敏原的鑒定

中華絨螯蟹粗提物電轉移至NC膜，轉印后的凝膠經考馬斯亮藍染色后蛋白質電泳膠片無可見蛋白質條帶，證明轉印較完全。蟹過敏患者陽性血清池對中華絨螯蟹粗提蛋白的免疫印跡結果顯示，粗提物中能與中華絨螯蟹過敏患者血清反應的組分有7種，分子質量在37.2～89.1 kDa之間，主要有 37.2、43.1、47.9、53.7、67.6、75.9和 89.1 kDa（圖2）。

2.4 ?輻照對中華絨螯蟹過敏蛋白溶液濃度和濁度的影響（n =3）

隨著輻照劑量的增加，中華絨螯蟹過敏蛋白濃度呈先增加后降低的趨勢，濁度隨劑量的變化趨勢與濃度大致相似（表1）。其原因可能是輻照導致部分蛋白發生變性，使疏水基團外露，發色基團藍移動，同時吸光度增加[18]。輻照劑量為15 kGy時濃度和濁度都達到最大值，輻照劑量達到20 kGy時，輻照使蛋白變性形成大的顆粒而部分沉淀，過敏原溶液經輻照后其水溶性下降，使得蛋白濃度降低，濁度也隨之降低。

2.5 ?輻照對中華絨螯蟹過敏蛋白疏水性的影響

熒光探針8-苯氨基-1-萘磺酸（ANS）在水溶液中的熒光強度很弱，但是當ANS與蛋白質表面的疏水性基團相結合時，熒光強度就會增強。通過熒光強度的變化可以反映蛋白質疏水性的變化。如圖3所示，隨著輻照劑量的增加，中華絨螯蟹過敏蛋白溶液的疏水性呈先增加后下降的趨勢，在輻照劑量20 kGy時達到最大值。推測疏水性變化的原因可能是蛋白質的疏水基團隨輻照劑量的增加逐漸外露，當劑量繼續增加時，蛋白分子發生降解或交聯，疏水基團減少。這與蛋白輻照后濁度的變化有一定的關系。

2.6 ?輻照對中華絨螯蟹過敏蛋白濃度的影響

十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果（圖4）表明，與未輻照的溶液相比，輻照后過敏蛋白的含量隨輻照劑量的增加而下降，到20 kGy時，過敏蛋白含量下降明顯，30 kGy時僅看見75.9 kDa大小的蛋白條帶;大于30 kGy的處理幾乎看不見任何條帶，大分子蛋白條帶的減少伴隨小分子蛋白混合物的增加;新生成的蛋白條帶分子質量在42 kDa左右;當輻照劑量達到20 kGy時，新生成的條帶也開始降解，并無新的蛋白條帶產生，當輻照劑量達到45 kGy時所有的條帶完全消失。

2.7 ?輻照對中華絨螯蟹過敏蛋白抗原性的影響

隨著輻照劑量的增加，過敏蛋白的濃度和免疫原性均逐漸降低（圖5）。未輻照樣品出現3條較為明顯的蛋白條帶（圖5a），過敏患者血清免疫反應中出現6條明顯的印跡（圖5b），這說明未輻照樣品有5種不同分子質量蛋白組分發生過敏反應，分布在37.2～89.1 kDa之間。當輻照劑量為9 kGy時，蛋白含量減少，且在35～55 kDa之間因降解產生新的混合蛋白成分;對于過敏患者血清中，除原蛋白組分的隱約3條印跡外，新組分未發現有過敏反應，并不具有免疫原性，而且隨著輻照劑量的增加，過敏蛋白與血清的反應越來越弱，45 kGy輻照后的NC膜上基本看不到痕跡。標準分子量沒有與過敏患者血清發生反應，也可以排除蛋白的非特異性結合。可見，輻照9 kGy可明顯降低過敏蛋白的免疫原性，輻照20 kGy時中華絨螯蟹蛋白溶液失去過敏性。

3 ?討論

蟹在中國廣泛分布，蟹類及其制品含有豐富的蛋白質，并且味道鮮美，深受人們的喜愛，但對于這種常見的水產品，嚴重過敏者甚至會發生過敏性休克。在對中華絨螯蟹過敏原的研究中，陳偉等[19]的研究顯示中華絨螯蟹中的主要過敏原是分子質量為 66 kDa和76 kDa的蛋白，吳興達[20]的研究則認為中華絨螯蟹的主要過敏原為分子質量在35、41、48、66 kDa的蛋白。本試驗結果表明，分子質量在 37.2～89.1 kDa之間的7種蛋白為中華絨螯蟹的主要過敏原，與文獻報道的分子量范圍一致，可能由于中華絨螯蟹地域不同，導致了過敏原分子質量的差異性。

國內外的研究發現，已知食物主要過敏原對熱、酸、蛋白酶穩定，常規的加工處理很難達到清除過敏原的要求[21]。輻照處理對蝦過敏蛋白、雞蛋中的卵粘蛋白（OM）、牛奶中的α-乳球蛋白（BLG）都有破壞作用，均能使它們的過敏性下降，抗原表位破壞[22-24]。輻照處理使蛋白質一級結構中的部分氨基酸發生分解或氧化，部分蛋白質大分子還會發生解聚、交聯、裂解以及空間結構、構象的改變，破壞蛋白質在生物體中的結構，蛋白質的生物學功能結構遭到破壞，喪失生物活性[14，25-27]。本試驗在利用輻照技術處理中華絨螯過敏蛋白的研究中發現，隨著輻照劑量的增加，蛋白濃度降低，蛋白組分含量下降，濁度增高，過敏性逐漸下降。SDS-PAGE電泳中，3～15 kGy輻照后，產生分子質量約42 kDa的蛋白條帶，20 kGy輻照后過敏蛋白降解的趨勢明顯，45 kGy輻照后，蛋白已經降解完全，且免疫印跡結果顯示抗原決定簇被掩蓋或破壞。

明膠蛋白質含水條件下輻照會導致游離氨基酸殘基含量的持續下降，交聯度逐漸增加、特性粘度下降和不溶物的出現[28]。本試驗中過敏蛋白溶液輻照后也有類似的發現。過敏蛋白濁度隨劑量的增加呈先增加后下降的趨勢，這是因為過敏原溶液經輻照后發生交聯和變性反應，導致水溶性下降，濁度增加，隨著交聯反應程度的增加，小分子不溶物聚集、沉淀，濁度又隨之降低。濁度的變化使蛋白質濃度測定時受到一定程度的影響。

疏水基的相互作用在維持蛋白質的三級結構穩定性方面起重要作用，蛋白的疏水性和巰基含量的變化反應蛋白的變性程度。李迎秋等[29]發現，高壓脈沖電場處理時間越長，大豆分離蛋白的疏水性和巰基含量越高。本試驗中，輻照后蛋白的疏水性增加的現象與前人研究部分相似，不同之處是，過敏原蛋白受到輻照后，疏水性隨輻照劑量的增加呈先升后降的趨勢，推測疏水性變化的原因是，蛋白質的疏水基團隨輻照劑量的增加逐漸外露，當劑量繼續增加時，蛋白分子發生降解或交聯，疏水基團減少，具體結論有待進一步分析。endprint

4 ?小結

中華絨螯蟹蛋白粗提液蛋白分子質量范圍為18.6～89.1 kDa，蛋白條帶分子質量分別為18.6、20.1、23.4、27.1、37.2、41.7、43.1、47.9、53.7、67.6、75.9和89.1 kDa;與中華絨螯蟹過敏患者血清反應的蛋白組分有7種，分子質量在 37.2～89.1 kDa之間，主要有 37.2、43.1、47.9、53.7、67.6、75.9和 89.1 kDa。中華絨螯蟹蛋白粗提液蛋白濃度和免疫原性隨輻照劑量的增加而降低，疏水性和濁度隨輻照劑量的增加呈先上升后下降的趨勢。

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