響應面法優化超聲波輔助提取河陰石榴多糖工藝研究

閆生輝+李興奎+高玉紅

摘要：為了優化河陰石榴（Punica granatum L.）多糖的超聲波提取工藝，研究了超聲波提取時的提取溫度、液料比、超聲功率和超聲時間單因素條件對河陰石榴多糖提取效果的影響，在此基礎上，根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，采用三因素三水平響應面分析法建立二次回歸模型，同時對各因素和因素交互作用進行方差分析，從而確定河陰石榴多糖超聲提取的最佳工藝條件為提取溫度48.5 ℃，提取時間36 min，超聲波功率390 W。在此條件下，石榴多糖提取率的預期值為15.95%，試驗驗證值為15.68%。將優化后的試驗條件與傳統的水提法相比，不但提高了石榴多糖提取的效率，而且多糖得率提高了5.79個百分點。

關鍵詞：河陰石榴（Punica granatum L.）;多糖;超聲波提取;響應面分析

中圖分類號：S665.4 ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? 文章編號：0439-8114（2015）23-5987-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.049

Optimization of Polysaccharides from Heyin Pomegranate Using Response Surface Methodology and Ultrasonic Extraction

YAN Sheng-hui，LI Xing-kui，GAO Yu-hong

（Zhengzhou Vocational Technology College， Zhengzhou 450121， China）

Abstract： In order to optimize ultrasonic extraction of polysaccharides in Heyin Pomegranate（Punica granatum L.），effects of extraction temperature，ratio of water to material，extraction rate and extraction time were investigated respectively in single-factor tests. Based on the principle of Box-Behnken design， response surface methodology with three factors and three levels were applied，and then interactive effects of the independent variables on extraction were established. The result showed that the optimum extraction temperature，time，and rate for polysaccharides extraction from Heyin Pomegranate are 48.5 ℃，36 min，390 W，respectively. Under the above conditions，the actual extraction rate reached up to 15.68%， which was close to the predicted value of 15.95%.Compared with the traditional water extraction method，the efficiency of optimization of polysaccharides from Heyin Pomegranate was greatly improved，and the extraction yield of polysaccharide was increased by 5.79 percentage points.

Key words： Heyin Pomegranate（Punica granatum L.）; polysaccharides; ultrasonic extraction; response surface methodology

石榴（Punica granatum L.）是落葉喬木或灌木，屬于石榴科（Punicaceae）石榴屬（Punica L.）植物，原產巴爾干半島至伊朗及其鄰近地區，現主要分布在亞洲、非洲、歐洲沿地中海等溫帶和熱帶地區[1]。石榴在中國南北各地均有種植，主要分布在陜西、安徽、山東、江蘇、河南、四川、云南及新疆等地。目前，有瑪瑙石榴、粉皮石榴、青皮石榴、玉石子等70多個種類，其中河南省滎陽市的河陰石榴因其果實色澤鮮艷，石榴皮薄光滑，特別是石榴仁特軟可食，其味甘甜而無渣滓，結束了吃石榴吐子的歷史，因此河陰石榴暢銷全國，為河南特產之一。近年來，各國科研工作者陸續發現石榴中含有豐富的蛋白質、氨基酸、微量元素、類固醇、激素、生物堿和多糖等活性物質[2-5]，因此被廣泛應用于醫藥和保健領域。

多糖廣泛分布于自然界的多種生物體中，尤其是動物細胞膜、植物細胞壁和微生物細胞壁中，是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，是構成生命體的分子基礎之一。多糖具有多種藥理活性，它不僅可以作為廣譜免疫促進劑調節機體免疫功能，還在抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖、抗輻射等方面發揮廣泛的藥理作用。迄今為止，已有300多種多糖類化合物從天然產物中分離出來，其中從植物中提取的水溶性多糖最為重要。因為其藥理活性強，來源廣泛，細胞毒性低，安全性強，毒副作用較小，已引起醫藥界的廣泛關注，并成為當今生命科學研究的熱點之一[6-10]。endprint

超聲波輔助提取法是一種從植物中提取有效成分的重要方法，依靠的是超聲波的空化效應、熱效應和機械作用[11-14]，近年來被廣泛用于植物有效成分的提取研究。目前，關于河陰石榴超聲波多糖提取的工藝鮮有研究報道，本試驗將超聲波技術應用于河陰石榴的多糖提取工藝，并運用響應面法進行優化，從而得到最佳的提取工藝條件，為河陰石榴多糖的制備提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與儀器

滎陽市廣武鄉陣溝河陰石榴生產基地采集新鮮石榴，選取樣品以色澤鮮艷、外表光滑、大小適中為標準，室內常溫貯藏15 d。葡萄糖、無水乙醇、濃硫酸、苯酚等試劑均為分析純。

主要儀器和設備：組織搗碎機（DFT-250型），上海麥尚科學儀器有限公司;電熱恒溫干燥箱（WHL-25A型），河南省泰斯特儀器有限公司;紫外可見分光光度計（UV-1800型），日本島津公司;超聲波提取機（KB-50型），北京林子大科技有限公司;臺式低速離心機（80-2型），上海醫療機械有限公司;電子天平（WA），上海方瑞儀器有限公司。

1.2 ?河陰石榴中多糖的測定

河陰石榴中多糖的測定采用苯酚-硫酸法[15]。準確稱取標準葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各以去離子水補至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，搖勻冷卻，室溫放置20 min以后于490 nm測定吸光度，以2.0 mL水按同樣顯色操作為空白，以多糖質量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

取樣品1 g加1 mL 15%三氯乙酸溶液進行反復研磨，將清液和殘渣一起到入10 mL的離心管中進行離心。取上清液到25 mL錐形比色管中，加入2 mL 6 mol/L鹽酸之后搖勻，最后濾液保持18 mL左右，在96 ℃水浴鍋中水浴2 h。冷卻后加入2 mL 6 mol/L 氫氧化鈉定容至25 mL的容量瓶中。吸取0.2 mL的樣品溶液，以去離子水補至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，搖勻冷卻至室溫時進行測定。

根據試驗結果得到多糖濃度后計算多糖提取率：

多糖提取率=多糖質量/原料質量×100%

1.3 ?單因素試驗

1）提取溫度對河陰石榴多糖提取率的影響。分別取2.000 g預處理好的樣品5份，加入40 mL的去離子水后分別置于30、40、50、60、70 ℃的水浴中進行充分的溶解。在400 W的超聲波功率下提取35 min，測定不同提取溫度下河陰石榴多糖的提取率。

2）提取時間對河陰石榴多糖提取率的影響。分別取2.000 g預處理好的樣品5份，分別加入40 mL的去離子水后置于50 ℃的水浴中進行充分溶解。在400 W的超聲波功率下分別提取25、30、35、40、45 min，測定不同提取時間下河陰石榴多糖的提取率。

3）超聲波功率對河陰石榴多糖提取率的影響。分別取2.000 g預處理好的樣品5份，加入40 mL的去離子水后置于50 ℃的水浴中進行充分的溶解。分別在200、300、400、500、600 W的超聲波功率下提取35 min，測定不同超聲波功率下河陰石榴多糖的提取率。

4）液料比對河陰石榴多糖提取率的影響。分別取2.000 g預處理好的樣品5份，分別加入20、30、40、50、60 mL的去離子水后分別置于50 ℃的水浴中進行充分溶解。在400 W的超聲波功率下提取35 min，測定不同液料比下河陰石榴多糖的提取率。

1.4 ?響應面試驗

采用單因素試驗研究了提取時溫度、液料比、超聲功率和超聲時間對提取河陰石榴多糖的影響，從而確定提取溫度（X1）、提取時間（X2）和超聲波功率（X3）作為主要自變量，采用響應面法對河陰石榴多糖的提取工藝進行優化，采用Box-Behnken Design（BBD）進行試驗設計，通過擬合二次多項式方程，計算出最優工藝組合以及在此條件下河陰石榴多糖提取率的最大理論值[16-20]。以+1、0、-1分別代表自變量的高中低水平，以河陰石榴多糖提取率為目標，通過響應曲面分析對提取條件進行優化。響應曲面因素和水平如表1所示。

1.5 ?驗證與比較試驗

按照計算分析得到的最佳工藝條件進行提取試驗操作，從而驗證預測結果的準確性。并將試驗結果與傳統的水提法提取多糖的提取率進行結果比較[21]，證明優化后超聲波提取工藝的優越性。

2 ?結果與分析

2.1 ?單因素試驗結果

2.1.1 ?提取溫度對河陰石榴多糖提取率的影響 ?由圖1可知，在一定的條件下隨著提取溫度的升高，河陰石榴多糖的提取率逐漸增大，在50 ℃時，提取率達到最大，溫度繼續升高，對提取率影響不大?？赡苁窃诖藯l件下多糖分子已經具有了從樣品中脫離的動能，繼續升高溫度對提取率沒有明顯的影響。因此，最佳的提取溫度確定為50 ℃。

2.1.2 ?提取時間對河陰石榴多糖提取率的影響 ?由圖2可知，在一定的條件下，隨著提取時間的延長，河陰石榴多糖提取率逐漸上升，35 min時達到了峰值，繼續延長時間，提取率反而減小?？赡苁茄娱L時間有利于細胞內有效成分的釋放，然而過長時間導致了多糖在酸性條件下發生了水解，從而降低了提取效率。因此，最佳的超聲提取時間確定為35 min。

2.1.3 ?超聲波功率對河陰石榴多糖提取率的影響 ?由圖3可知，隨著超聲波功率的增大，河陰石榴多糖提取率呈先上升后下降的趨勢，在功率為400 W時提取率最高，可能是當超聲波的功率為400 W左右時，多糖分子具有的動能能夠使其最大限度地從樣品中釋放出來。然而隨著超聲波功率的繼續增大，可能使多糖分子具有了更大的能量，反而促使了多糖分子的降解，從而導致了提取率的降低。因此，最佳提取率確定為400 W。endprint

2.1.4 ?液料比對河陰石榴多糖提取率的影響 ?由圖4可知，在一定的條件下，隨著液料比的增大，多糖提取率逐漸上升，當液料比大于20∶1時對多糖提取率幾乎沒有影響，因此在進一步條件優化時，選擇液料比為20∶1的固定值。

2.2 ?響應面試驗結果

2.2.1 ?響應面試驗結果及方差分析 ?根據單因素試驗結果，結合RSM的中心組合試驗設計原理，取2.000 g預處理好的樣品17份，擇優選取提取溫度（X1）、提取時間（X2）和超聲波功率（X3）3個對多糖提取率相對重要的因素，采用三因素三水平的響應面分析方法分析優化工藝參數。響應面分析試驗結果見表2和表3。

從響應面方差分析表3可知，由試驗結果得到的模型F為17.34，P為0.000 5，表明該模型顯著。由模型擬合得到的回歸方程為R1=15.69-0.27X1+0.28X2+0.93X3-（7.5E-3）X1X2+0.13X1X2-0.28X2X3-0.28X12-0.80X22-X32，其方程的R2為0.957 1。方程中P值小于0.05的項代表顯著項，包括X1提取溫度，X2提取時間，X3超聲波功率及其二次項X22、X32。由擬合得到的回歸方程可知，各影響因素與響應值的關系并不是簡單的線性關系，方程的失擬度值為0.43，表示該回歸方程相對于絕對誤差而言失擬度并不顯著，能夠較準確地反映各影響因素與其響應值之間的關系，多糖的最佳提取工藝條件可以由此方程確定，得到最優提取工藝為河陰石榴多糖提取率最大預測值15.95%相對應的提取工藝條件為：提取溫度48.5 ℃，提取時間36.2 min，超聲波功率396.5 W。

2.2.2 ?試驗因素交互作用對響應值影響的3D分析 ?提取時間和提取溫度交互作用對響應值影響的3D分析如圖5所示。由圖5可知，提取時間和提取溫度對河陰石榴多糖的提取率影響不大。當溫度過高時多糖的提取率減少，可能是因為高溫導致多糖的分子結構發生了變化，從而影響了多糖的提取率。

提取時超聲波功率和提取溫度交互作用對響應值影響的3D分析如圖6所示。由圖6可知，當超聲波功率和提取溫度過高時，導致多糖提取率明顯下降，可能是因為在高溫時，過高的超聲波功率更容易破壞多糖分子的結構，從而導致多糖提取率的下降。

提取時超聲波功率和提取時間交互作用對響應值影響的3D分析如圖7所示。由圖7可知，當超聲波功率和提取時間超過一定值時，在過長的時間里高強度的超聲功率嚴重破環了多糖的組織結構，從而降低了多糖的提取率。

由以上分析可知，超聲波功率和提取溫度對響應值的影響較大，其交互項對試驗結果的影響也較大，而提取時間對試驗結果的影響較小，這和響應曲面的方差分析結果一致，這表明由各個試驗因素與響應值的關系模擬與試驗所得的數據較為吻合，因此可以用此模型得到多糖的最佳提取工藝條件。

2.3 ?最優提取工藝的驗證

根據以上分析并結合實際試驗操作條件，將河陰石榴多糖提取工藝條件修正為提取溫度48.5 ℃，提取時間36 min，超聲波功率390 W。河陰石榴多糖提取率為15.68%，接近預測值15.95%，結果較為理想。試驗采用傳統的水提法得到河陰石榴的多糖提取率為9.89%，相比于傳統的提取方法使多糖提取率提高了5.79個百分點。

3 ?小結

本試驗采用響應面法優化了超聲波輔助提取河陰石榴多糖的工藝，得到的最佳提取工藝條件為提取溫度48.5 ℃，提取時間36 min，超聲波功率390 W。在此條件下，河陰石榴多糖提取率的預期值為15.95%，試驗驗證值為15.68%。將優化后的試驗條件與傳統的水提法相比，不但提高了河陰石榴多糖提取的效率，而且多糖得率提高了5.79個百分點。

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