茶樹內生真菌研究進展

王雪萍+譚榮榮+曹丹+龔自明

摘要：茶樹（Camellia sinensis）內生真菌是重要的微生物資源，具有重大的研究和開發(fā)價值。目前已分離鑒定的茶樹內生真菌主要類群有刺盤孢菌（Colletotrichum）、擬盤多毛孢（Pestalotiopsis）、球座菌（Guignardia）、擬莖點霉（Phomopsis）、大莖點霉（Macrophoma.）、曲霉（Aspergillu）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、鏈格孢霉（Alternaria）、鐮孢霉（Fusarium）等。茶樹內生真菌的種類和數(shù)量因茶樹品種、茶樹不同部位、生長期、季節(jié)和環(huán)境的變化明顯不同。內生真菌能改變茶葉的化學成分，促進茶樹生長，產生具有抗菌作用的次級代謝產物。對近年來茶樹內生真菌的研究進展進行了簡要綜述。

關鍵詞：茶樹（Camellia sinensis）;內生真菌;分布;生物學作用

中圖分類號：S571.1;Q939.5 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）23-5808-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.004

Research Progress on Endophytic Fungi of Camellia sinensis

WANG Xue-ping， TAN Rong-rong， CAO Dan， GONG Zi-ming

（Institute of Fruit & Tea，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Tea Engineering and Technology Research Centre，Wuhan 430064，China）

Abstract： Endophytic fungi are important microbial resources which deserved to be researched and exploited. The reported endophytic fungi of tea are mainly Colletotrichum， Pestalotiopsis， Guignardia， Phomopsis， Macropho， Aspergillu， Trichoderma， Penicillium， Alternaria and Fusarium. The species and the quantity of endophytic fungi always varies with different tea varieties， parts， growth period， seasons and environments. Endophytic fungi can change the chemical component of tea， promote the growth of tea bushes， product secondary metabolites with antibacterial function. In this paper， the research advances on endophytic fungi of tea were reviewed.

Key words：Camellia sinensis;endophytic fungus; distribution;biological function

植物內生真菌（Endophytic fungi）是指其生活史中一定階段或全部階段生活于健康植物組織內部，對植物組織不引起明顯病害癥狀的一類真菌，它包括那些在其生活史中的某一階段營表生的腐生菌，對宿主暫時沒有傷害的潛伏性病原菌和菌根菌[1，2]。內生真菌是自然界生物資源和生物多樣性的重要組成部分[3]。1993年，Stierle等[4]首次報道從短葉紫杉（Taxus brevifolia）的樹皮中分離出1株能產生抗癌物質紫杉醇的內生真菌（Taxomyces andreanae）以來，掀起了植物內生真菌的研究熱潮。目前已從55科108屬153種3變種植物和海洋植物藻類中分離得到的內生真菌達到171屬[5]。植物內生真菌可提供植物所需要的營養(yǎng)物質，自身合成或促進植物合成生長素（IAA）、細胞分裂素（CTK）等激素來調節(jié)寄主生長代謝，產生活性物質以增強植物抗逆境、抗病害能力，可作為生物防治資源和新藥的來源，在農業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生等領域有著巨大的應用潛力[6]。

茶樹（Camellia sinensis O.ktze）是重要的經濟植物，是山區(qū)農民的主要收入來源，中國是茶樹發(fā)源地，茶樹栽培已有3 000多年的歷史，茶樹內生真菌已和茶樹形成一種長期協(xié)同進化的關系，但對茶樹內生真菌的研究起步較晚、研究較少。目前，主要研究了茶樹內生真菌的種類、內生真菌在茶樹體內的分布特征、內生真菌與茶樹的相互作用及其生物學功能等。本文從以上3個方面進行簡要綜述。

1 ?茶樹內生真菌的主要類群

同一植物可分離出數(shù)種至數(shù)十種內生真菌，有的多達數(shù)百種[7]。內生真菌分布在健康茶樹不同組織中，特別是在葉片和枝條中更為豐富，成熟葉片的分離頻率高達93.88%～100.00%，同一茶樹葉片可分離3種以上內生真菌，最多可分離到6種內生真菌[8]，許多類群常包含不止一種真菌[9-11]。盧東升等[12]從豫南茶園5 760個組織塊中分離純化內生真菌菌株579個，經鑒定，得到內生真菌7科15屬18種，主要由子囊菌與半知菌構成，其中半知菌種類較多，未發(fā)現(xiàn)擔子菌與接合菌種類。游見明[13，14]從四川省自貢市榮縣五通農場茶園的茶樹根、莖、葉中分離得到內生真菌14屬。胡雲(yún)飛等[15]在南京市紫金山中山陵十年生“龍井長葉”未耕墾茶園的健康根系中分離得到7屬12種內生真菌，其中一個為未知種。周游等[16]從白葉單叢成熟葉片、嫩葉和嫩莖中分離到內生真菌，分別屬于6個屬。Agusta等[17]采用RAPD分析對茶樹內生真菌進行了分類， 將分離獲得的35株內生真菌劃分為6個類群，其中一組為鐮刀菌屬（Fusarium sp.），一組為青霉屬（Penicillium sp.），兩組為裂褶菌屬（Schizophyllum sp.），另兩組為間座殼屬（Diaporthe sp.）。

目前已報道的茶樹內生真菌主要類群（表1）有擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis spp.）、刺盤孢菌屬（Colletotrichum spp.）、球座菌屬（Guignardia sp.）、大莖點霉屬（Macrophoma）、擬莖點霉菌（Phomopsis sp.）、青霉屬（Penicillium spp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）、木霉屬（Trichoderma sp.）、鐮刀菌屬（Fusarium spp.）、鏈格孢屬（Alternaria sp.）等。優(yōu)勢內生真菌有刺盤孢屬（Colletotrichum sp.）[7，12，18]、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis sp.）[7，12，18]、球座菌屬（Guignardia spp.）[7，18]、擬莖點霉屬（Phomopsis sp.）[12]，大莖點霉屬（Macrophoma sp.）[12]、曲霉屬（Aspergillu ssp.）[7]、木霉屬（Trichoderma sp.）[13，18]、鏈格孢屬（Alternaria sp.）[13]、鐮刀菌屬（Fusarium spp.）[13]和叢赤殼屬（Nectria sp.）[13]。

2 ?內生真菌在茶樹體內的分布和定殖

2.1 ?內生真菌在茶樹體內的分布具有明顯的組織專化性

內生真菌在茶樹體內的分布具有明顯的組織專化性，在其種類和數(shù)量上表現(xiàn)為葉、枝條>花托、種托>種皮、根>芽、種胚、花瓣的明顯趨勢。不同部位內生真菌的分布存在差異，有各自的優(yōu)勢菌群。游見明[13]研究發(fā)現(xiàn)，根中的優(yōu)勢菌群主要是鐮孢霉屬（Fusarium spp.）、叢赤殼屬（Nectria sp.），而莖中主要是木霉屬（Trichotderma sp.），葉中主要是鏈格孢屬（Alternaria sp.）。戴清良等[19]在研究內生炭疽菌在茶樹體內的分布時發(fā)現(xiàn)，茶樹枝條和葉片中能分離到相對較為豐富的內生炭疽菌，但在主莖、根、花和果實等部位難于分離獲得內生炭疽菌。徐焰平等[20]研究結果表明，芒果球座菌主要分布于茶樹葉片中，分離率達69.91%;枝條中的分離率很低，只占3.09%;而根、種子、花和新長出的實生苗中分離不到芒果球座菌。

2.2 ?品種、生長期對茶樹內生真菌的影響

茶樹品種不同，內生真菌的分布存在明顯差異。謝麗華等[22]選擇福建省福州市、安溪縣4個廣泛栽培的茶樹品種進行葉部內生真菌分離，黃旦葉片中的內生真菌分布最為普遍，分離頻率高達100%，福云6號內生真菌的分離頻率達71.%，而鐵觀音和毛蟹葉片內生真菌的分離頻率僅為55%;研究還發(fā)現(xiàn)茶樹品種也影響內生真菌的組成和結構，內生球座菌（Guignardia spp1）在黃旦葉片中分離頻率最高，占所分離內生真菌的95%，而在毛蟹中只占7.4%。徐焰平等[20]從5個茶樹品種中分離芒果球座菌，以鐵觀音分離頻率最高，達87.89%，肉桂最低，只有28.07%;鐵觀音中，芒果球座菌在內生真菌的群體中占據(jù)明顯的優(yōu)勢，但在肉桂中，除分離到芒果球座菌外，也能分離到較多的炭疽菌屬和擬盤多毛孢屬的真菌。

隨著茶樹葉片的成熟，葉片中內生真菌的種類與數(shù)量逐漸增多，老葉中內生真菌分布普遍，嫩葉中分布相對較少[18，22]。葉片齡期影響茶樹內生真菌的種群結構，茶樹從芽到葉片展開、成熟的過程中，內生炭疽菌的分離率逐漸上升，但之后隨著葉片的老化，分離率又逐步下降，而芒果球座菌的分離率隨著葉片齡期的增長逐步提高，在老葉中，球座菌逐漸上升為優(yōu)勢菌[19，20]。

2.3 ?季節(jié)及氣候對茶樹內生真菌的影響

茶樹內生真菌分離率及真菌數(shù)量均受季節(jié)變化的影響。游見明[13，14]研究發(fā)現(xiàn)四川省自貢市榮縣茶園內茶樹內生真菌在3～5月的檢出率較高，7～8月檢出率相對較低，1月介于二者之間。李小容[25]研究認為，福州市金山區(qū)茶園內5月、10月分離獲得的真菌種類較為豐富，2月分離獲得的真菌種類較少。徐焰平等[20]研究結果表明，芒果球座菌在茶葉中常年都有分布，2～4月和6月芒果球座菌的分離率低，而5月、7～8月和12月是芒果球座菌分布的高峰期。胡雲(yún)飛等[15]對茶樹根系內生真菌季節(jié)多樣性分析研究認為，茶樹根系內生真菌在春、夏、秋3個季節(jié)的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)差異不大，而Pielou均勻度指數(shù)差異明顯，以夏季最高，秋季次之，春季最低，認為春季和秋季氣溫適宜，茶樹生長旺盛，根系內生真菌中優(yōu)勢菌種的生長抑制了其他弱勢真菌，從而導致春、秋季內生真菌均勻度指數(shù)小于夏季。

3 ?內生真菌與茶樹的相互關系

內生真菌和茶樹長期共生，協(xié)同進化，成為茶樹組織中不可分割的一部分。離體條件下，許多植物的內生真菌能產生豐富的、包括多酚類物質在內的抗菌代謝產物[26]。徐焰平[11]挑選芒果球座菌進行藥瓶培養(yǎng)后經液相色譜分析，推測芒果球座菌的次生代謝產物是茶多酚中的表兒茶素沒食子酸酯或表兒茶素沒食子酸酯的類似物。戴清良[27]研究認為內生炭疽菌的感染導致茶葉細胞中多酚類物質的積累。茶樹內生芒果球座菌對茶多酚具有很強的分解能力，可以降解兒茶素，并產生新的化合物[24，28]。國外學者研究發(fā)現(xiàn)從茶樹體內分離到的內生間座殼屬真菌能夠改變兒茶素的化學結構，將其氧化為其他物質[29-31]。陳煙蘭等[28]研究表明茶樹內生芒果球座菌、刺盤孢菌和擬盤多毛孢菌均能不同程度地產生纖維素酶和脂肪酶，供試的 15個內生真菌菌株均能不同程度地產生單寧酶。

內生真菌影響茶葉化學成分，同樣茶葉化學成分對內生真菌也有影響。PDA液體培養(yǎng)基中加入不同濃度的茶多酚后將不同程度抑制芒果球座菌的生長，濃度越大對芒果球座菌的抑制能力越強[24，28]。謝麗華[32]發(fā)現(xiàn)在PDA培養(yǎng)基中添加15%的茶多酚對茶樹內生刺盤孢菌、擬盤多毛孢菌、球座菌這3種茶樹上的主要內生真菌均有一定的抑制作用。

4 ?茶樹內生真菌的生物學功能

4.1 ?茶樹內生真菌的抑菌作用

內生真菌對外源微生物感染有著抑制作用，同時促進植物抗病性表達[33]。茶樹內生木霉菌具有極強的生長能力，表現(xiàn)出很強的生態(tài)競爭能力，使敏感菌難于生長，其代謝產物對許多絲狀病原菌有明顯的抑制作用[27，32，34]。內生青霉菌對金黃色葡萄球菌具有很強的敏感性，對茶輪斑病菌和茶云紋葉枯病菌也具有較強的抑制作用[32]。內生淡紫擬青霉FHM對7種茶樹內生真菌和10種植物病原菌均有較強的抑菌作用，經乙酸乙酯提取的FHM發(fā)酵液能對茶芽枯病菌、茶輪斑病菌和茶炭疽病菌等茶樹的病原真菌，以及白色念珠菌、枯草芽孢桿菌等菌株起抑制作用[34，35]。此外，內生擬盤多毛孢雖然生長速度較慢，但當其度過停滯期，對其他菌的生長也會產生拮抗作用[32]。內生炭疽菌能誘導茶葉細胞產生抗性反應[27]，內生曲霉的代謝產物對許多絲狀病原菌有明顯的抑制作用[27]，而曲霉CSN-3和長枝木霉CSN-18的混合培養(yǎng)液對茶花褐斑病、茶云紋葉枯病菌有明顯的抑制作用[36]。

4.2 ?茶樹內生真菌促生長作用

武漢琴等[37]采用分離自健康茶樹葉片組織的一株長枝木霉Trichoderma longibrachiatum菌株CSN-18回接茶苗，接種后一個月可以從茶苗的莖和葉組織中再分離獲得該真菌，茶樹組培苗接種條件下，組培苗長勢比對照組好，葉色更綠;但在實生苗條件下，沒有觀察到明顯的促生作用。可能在實生苗條件下，生長環(huán)境更為復雜，影響因素更多，因而效果不明顯。但茶樹組培苗和實生苗的人工接種均表明CSN-18對茶樹苗沒有明顯的致病作用。

5 ?茶樹內生真菌的綜合利用

盧東升等[38]研究發(fā)現(xiàn)茶樹內生真菌中大多數(shù)菌株能產生油脂類代謝產物，產油真菌菌株所占比例與真菌種類相關，不同真菌種類及同一種真菌不同菌株之間產油性狀有明顯差別，擬莖點霉屬（Phomopsis）、鐮刀菌屬（Fusarium）中產油菌株中較多，而供試的青霉菌各菌株均不產油脂。茶樹內生真菌油脂為棕黃色黏稠液體，具芳香氣味，茶葉提取液可促進內生真菌油脂的合成。

6 ?展望

內生真菌廣泛分布于植物中，其種類和數(shù)量往往和寄主植物的生長環(huán)境、生長時間、當?shù)氐臍夂驐l件、植物的采樣部位以及分離方法等有著密切的關系。目前主要在福建、河南、四川、廣東、浙江等省份小部分茶園進行了茶樹內生真菌的分離鑒定，采樣的茶園也主要是生產茶園，缺少對全國主要產茶省份產茶縣市茶園內生真菌分離鑒定的系統(tǒng)研究，采樣對象也沒有涉及到野生茶樹，進行系統(tǒng)研究分離鑒定后，茶樹內生真菌的種類和數(shù)量及其分布將更為豐富。

內生真菌可促進宿主植物生長、提高宿主植物抗逆境性、抗動物（昆蟲、線蟲、食草哺乳動物等）攝食、抗非生物脅迫、抗病原菌以及他感等。茶樹內生真菌的生物學作用研究起步較晚，目前主要進行了抑菌方面的研究，發(fā)現(xiàn)了一株內生木霉真菌能促進組培茶苗生長。中國是茶樹發(fā)源地，茶樹人工栽培已有幾千年的歷史，茶樹內生真菌長期與茶樹共生、協(xié)同進化，而茶葉具有很強的藥理作用，通過對茶樹內生真菌進行遺傳改良、代謝調控、培養(yǎng)條件的優(yōu)化等手段提高茶樹活性成分的含量和產量，探討出茶樹內生真菌進行茶葉有效成分的生物轉化機理，研究茶樹內生真菌次生代謝產物，可望開發(fā)出對人和動物潛在毒性較低或無毒的藥物，提高其綜合利用價值。

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