不同針灸方法對膜迷路積水模型豚鼠聽力及耳蝸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

研究報告

不同針灸方法對膜迷路積水模型豚鼠聽力及耳蝸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

蔣麗元， 倪芳英， 王燦軍， 陳華德

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州，浙江310053)

【摘要】目的探討不同針灸方法干預(yù)對豚鼠膜迷路積水的效應(yīng)差異。方法50只豚鼠隨機分為空白組、模型組、針刺組、艾灸組、電針組，每組10只。采用腹腔注射醛固酮的方法誘導(dǎo)膜迷路積水模型。各治療組分別在“百會”“聽宮”實施相應(yīng)穴位刺激，每日1次，連續(xù)治療10 d。治療結(jié)束后，行聽覺腦干誘發(fā)電位測試，觀察聽閾值。HE染色法觀察耳蝸積水程度，計算蝸管橫截面積與蝸管加前庭階橫截面積之和的比值(R值)。結(jié)果1針刺組、艾灸組、電針組聽閾值均較模型組降低(P<0.01)，電針組聽閾值較艾灸組、針刺組降低(P<0.01)，艾灸組聽閾值較針刺組降低(P<0.05)。2針刺組、艾灸組、電針組R值均較模型組降低(P<0.01)，電針組R值較針刺組、艾灸組降低(P<0.01，P<0.05)，艾灸組R值較針刺組降低(P<0.01)。結(jié)論針刺、艾灸、電針刺激“百會”“聽宮”均能減輕豚鼠膜迷路積水，并且改善耳蝸聽功能。電針表現(xiàn)出最好的效應(yīng)，優(yōu)于艾灸、針刺；艾灸優(yōu)于針刺。

【關(guān)鍵詞】針刺；艾灸；電針；膜迷路積水；豚鼠

[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助(編號：81373757)。

[作者簡介]蔣麗元(1985-)，女，浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院2013級博士生，研究方向：針灸治療眩暈的臨床與實驗研究。E-mail： 360741751@qq.com。

[通訊作者]陳華德(1957-)，男，醫(yī)學(xué)博士，教授、博士生導(dǎo)師、主任中醫(yī)師。E-mail： docchd@sina.com。

【中圖分類號】R33【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.006

Effects of acupuncture, moxibustion and electro-acupuncture on the

hearing and morphology of cochlea in guinea pig models of

endolymphatic hydrops

JIANG Li-yuan, NI Fang-ying, WANG Can-jun, CHEN Hua-de

(Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053，China)

Abstract【】ObjectiveThis study was conducted to compare the efficacy of acupuncture, moxibustion and electro-acupuncture on guinea pig models of cochlear endolymphatic hydrops. Methods Fifty healthy male guinea pigs (body weight 200-250 g) were randomly divided into five groups: the normal group, model group, acupuncture group, moxibustion group, and electro-acupuncture group (n=10 in each group). Forty guinea pigs received a once-daily intraperitoneal injection of aldosterone in a dose of 100 μg/100 g/d for 5 days to induce endolymphatic hydrops. After a 2-month interval, the animals of the acupuncture, moxibustion and electro-acupuncture groups were treated with corresponding acupoints stimulation at points Baihui (GV 20) and Tinggong (SI 19) once a day for 10 days, respectively. We measured the hearing threshold of the auditory brainstem response (ABR) and evaluated pathologically the degree of hydrops using hematoxylin-eosin staining, and then the ratio of scala media (SM) area / [SM + scala vestibuli (SV) area] was calculated. Results1. The hearing threshold of ABR in the acupuncture, moxibustion and electro-acupuncture groups were all significantly lower than that of the model group (P<0.01). The ABR threshold in the electro-acupuncture group was significantly decreased in comparison with that of the acupuncture and moxibustion groups (P<0.01 for both). The hearing threshold of the moxibustion group was significantly lower than that of the acupuncture group (P<0.05). 2. The ratio of SM / (SM + SV) in the acupuncture, moxibustion and electro-acupuncture groups were all significantly lower than that of the model group (P<0.01). The ratio in the electro-acupuncture group was significantly decreased in comparison with that of the acupuncture and moxibustion groups (P<0.01, P<0.05). The ratio of the moxibustion group was significantly lower than that of the acupuncture group (P<0.01). ConclusionsOur findings suggest that all acupuncture, moxibustion and electro-acupuncture at the acupoints Baihui (GV 20) and Tinggong (SI 19) can significantly suppress the development of endolymphatic hydrops and improve the cochlear function in guinea pigs. Electro-acupuncture is the most effective in this experiment, and moxibustion therapy shows better effect than acupuncture.

【Key words】Acupuncture; Moxibustion; Electro-acupuncture; Endolymphatic hydrops; Guinea pig

梅尼埃病(Meniere’s disease，MD)是一種臨床常見疾病。膜迷路積水被認(rèn)為是MD的基本病理改變[1]。其典型的臨床表現(xiàn)為陣發(fā)性眩暈，感音神經(jīng)性聽力下降，耳悶、耳鳴伴惡心、嘔吐，嚴(yán)重影響患者生活。臨床對于MD尚無特效治療方法[2]，西醫(yī)主要是使用利尿劑、激素、麻醉劑、血管擴張劑[3]等藥物，其對癥狀改善不甚理想。手術(shù)治療適應(yīng)范圍較窄，療效不穩(wěn)定，并且術(shù)后可能出現(xiàn)各種并發(fā)癥[4]。

MD屬于祖國醫(yī)學(xué)“眩暈”范疇?！兜は姆ā分姓f：“眩者言其黑運轉(zhuǎn)旋，其狀目閉眼暗，身轉(zhuǎn)耳鳴，如立舟車之上，起則欲倒?！笔菍D很形象的描述。歷代醫(yī)家在針灸治療眩暈病方面積累了豐富的經(jīng)驗[5]?，F(xiàn)代研究表明，針刺療法可使眩暈癥狀在短期內(nèi)消失[6]，耳鳴耳聾減輕，對癥狀的改善可能與其改善血管運動神經(jīng)、植物神經(jīng)功能，緩解迷路痙攣，減輕膜迷路積水有關(guān)[7]。電針是針刺方法的一種，是在傳統(tǒng)針刺基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。與傳統(tǒng)針刺相比，電針通過不間斷的電流刺激提高穴位局部治療效應(yīng)。另外，電流產(chǎn)生的電場使耳部組織的離子發(fā)生定向運動，產(chǎn)生正負(fù)極化共振過程，促進組織恢復(fù)[8]。艾灸對MD的治療臨床也多有報道[9]。研究者分析認(rèn)為，艾灸在燃燒過程中輻射出的近紅外線，可以激發(fā)穴位內(nèi)生物分子氫鍵，通過神經(jīng)-體液系統(tǒng)傳遞人體細(xì)胞所需能量，從而緩解臨床癥狀[7]。針刺、電針、艾灸治療MD效果滿意[10,11]。本實驗通過觀察針刺、電針、艾灸三種針灸療法刺激“百會”“聽宮”穴治療豚鼠膜迷路積水的效應(yīng)差異，以期為臨床優(yōu)選治療MD療法提供實驗依據(jù)。

1材料和方法

1.1實驗動物

健康白色紅目豚鼠50只，雄性，體重(200～250)g，耳廓 Preyer 反射靈敏，耳鏡檢查無中耳疾病，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供(生產(chǎn)合格證號:SCXK(浙)2013-0060，使用合格證號:SYXK(浙)2013-0184 )。實驗過程中對動物的處置符合《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.2主要試劑及儀器

醛固酮(Sigma，A9477)，RapidCal·ImmunoTM脫鈣劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，無煙艾條(120 mm×13 mm)，華佗牌無菌針灸針(0.25 mm×25 mm)，HANS-100A型鎮(zhèn)痛電針儀(南京醫(yī)療儀器廠)，聽覺腦干誘發(fā)電位儀(美國GSI公司)。

1.3動物分組與模型建立

將50只豚鼠按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、針刺組、艾灸組、電針組，每組10只。除空白組外，其余4組動物按100 μg/100 g/d給予醛固酮腹腔注射，連續(xù)5 d，第6天開始各組不予處理，常規(guī)飼養(yǎng)，60 d后造模結(jié)束[12,13]，開始實施干預(yù)措施。

1.4處理方法

空白組：同樣固定不進行任何處理；模型組：膜迷路積水模型，同樣固定；針刺組：用針灸針在百會穴向前平刺2 mm，左側(cè)聽宮穴直刺3 mm(穴位定位參照《實驗針灸學(xué)》[14])，留針20 min，1次d，連續(xù)治療10 d；艾灸組：將艾條點燃施灸，點燃的一端與百會穴、左側(cè)聽宮穴處皮膚保持2~3 cm距離，反復(fù)均勻地旋轉(zhuǎn)移動進行灸治，灸20 min，1次d，連續(xù)治療10 d；電針組：用針灸針在百會穴向前平刺2 mm，左側(cè)聽宮穴直刺3 mm，接HANS-100A型鎮(zhèn)痛電針儀。刺激參數(shù)：輸出電流1 mA，頻率為2/15疏密波，留針20 min，1次d，連續(xù)治療10 d。

1.5指標(biāo)檢測

1.5.1ABR檢測[15，16]：治療結(jié)束后，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉豚鼠，采用聽覺腦干誘發(fā)電位儀在聲電屏蔽室內(nèi)記錄豚鼠左耳ABR反應(yīng)閾值。電極位置為：記錄電極置于顱頂正中，參考電極置于受檢耳后乳突區(qū)，接地電極置于對側(cè)耳后乳突區(qū)。刺激聲為0.1 ms交替脈沖激發(fā)的交替短聲(click)，刺激時間為10 ms，疊加1 024次，刺激聲強度從80 dB nHL開始測試，開始以10 dB遞減，待III 波不甚明顯或者延遲靠后時，說明接近閾值，然后改為5 dB遞減，以剛能分辨出III 波的刺激強度確定閾值，并至少重復(fù)2次，取其平均值作為閾值。

1.5.2組織學(xué)指標(biāo)： 豚鼠ABR測試結(jié)束后，自胸骨劍突處作“U”型切口打開胸腔雙側(cè)達(dá)腋下，暴露心包，剪開心包，以灌注針頭自心尖刺入，達(dá)主動脈根部，固定針頭，剪開右心耳，先以生理鹽水灌注，至右心耳流出液體變?yōu)榍辶粒臑?%多聚甲醛 (pH 7.4)灌注，至頭頸、四肢完全僵硬后快速斷頭，取出左側(cè)聽泡，打開聽泡后剪修，充分暴露耳蝸。將標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定，48 h后，將耳蝸標(biāo)本置于RapidCal·ImmunoTM脫鈣劑內(nèi)，脫鈣約3 d后，自來水沖洗過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。將耳蝸標(biāo)本沿平行于蝸軸的平面切片，切片厚度為4.5 μm，每個標(biāo)本取2張切片行HE染色。

1.6圖像分析

運用Image Pro Plus 6.0圖像采集分析系統(tǒng)分析HE染色切片。以耳蝸第二轉(zhuǎn)觀察膜迷路積水程度[17]，計算蝸管橫截面積與蝸管加前庭階橫截面積之和的比值(R)，2張切片取平均值，作為該只豚鼠的R值。膜迷路積水分度標(biāo)準(zhǔn)[12]：R值介于1/3～1/2之間為輕度積水，R值介于1/2～2/3之間為中度積水，R值在2/3以上為重度積水。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1聽閾值變化

與空白組比較，模型組聽閾值顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，各治療組聽閾值顯著降低(P<0.01)；各治療組間比較，電針組聽閾值低于針刺組、艾灸組(P<0.01，P<0.05)，艾灸組聽閾值低于針刺組(P<0.05)(表1)。

表1　各組聽閾值比較

注：與空白組比較，★★P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01；與針刺組比較，■P<0.05，■■P<0.01；與艾灸組比較，※※P<0.01。

Note.★★P<0.01 vs. control group;△△P<0.01 vs. model group;■P<0.05,■■P<0.01 vs. acupuncture group;※※P<0.01 vs. moxibustion group.

2.2HE染色

空白組10只豚鼠耳蝸均無膜迷路積水；模型組表現(xiàn)為6只中度積水，4只重度積水；針刺組表現(xiàn)為2只輕度積水，8只中度積水；艾灸組表現(xiàn)為7只輕度積水，3只中度積水；電針組表現(xiàn)為1只無膜迷路積水，8只輕度積水，1只中度積水。與空白組比較，模型組R值顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，各治療組R值顯著降低(P<0.01)；各治療組間比較，電針組R值顯著低于艾灸組、針刺組(P<0.01)，艾灸組R值顯著低于針刺組(P<0.01)(表2)。

空白組耳蝸前庭膜平直無膨隆，與基底膜約成45°角，前庭階、鼓階、蝸管結(jié)構(gòu)均無異常。模型組表現(xiàn)為各回前庭膜向前庭階方向不同程度的隆起擴張，從頂轉(zhuǎn)到底轉(zhuǎn)積水程度逐漸加重，尤以第一、二轉(zhuǎn)積水最為明顯，前庭膜與基底膜之間大于90°角；針刺組、艾灸組、電針組前庭膜膨隆程度較模型組均有不同程度減輕(圖1，見文后彩插5)。

Tab.2Comparison of the R values of cochlea in

組別GroupsR值Rvalue空白組Control0.30±0.01模型組Model0.62±0.07★★針刺組Acupuncturegroup0.56±0.04△△艾灸組Moxibustiongroup0.48±0.03△△■■電針組Electro-acupuncturegroup0.42±0.05△△■■※

注：與空白組比較，★★P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01；與針刺組比較，■■P<0.01；與艾灸組比較，※P<0.05。

Note.★★P<0.01 vs. control group;△△P<0.01 vs. model group;■■P<0.01 vs. acupuncture group;※P<0.05 vs. moxibustion group.

3討論

古代文獻(xiàn)對眩暈病的病因病機多有論述。如《靈樞·海論》：“髓海不足，則腦轉(zhuǎn)耳鳴”，又如《靈樞·口問》：“上氣不足，腦為之不滿，耳為之苦鳴”，均表明髓海不足是該病的關(guān)鍵病機所在。百會穴為手足三陽、督脈之會，取百會可通髓海而健腦。MD病位在耳，聽宮穴位于耳前，為手太陽小腸經(jīng)穴，手太陽小腸經(jīng)又“卻入耳中”，經(jīng)脈所過，主治所及，故取聽宮穴可治療內(nèi)耳疾病。百會、聽宮是臨床治療內(nèi)耳眩暈的常用組穴[18，19]。因此，實驗選取百會、聽宮二穴治療豚鼠膜迷路積水。結(jié)果顯示，針刺、艾灸、電針刺激百會、聽宮均可減輕豚鼠膜迷路積水，并且改善耳蝸聽功能。

MD病程中反復(fù)發(fā)作的內(nèi)淋巴壓力增高可使內(nèi)耳感覺細(xì)胞變性，血管紋萎縮，逐步形成不可逆的感音神經(jīng)性耳聾[20]。研究表明，醛固酮可能通過激活耳蝸血管紋以及暗細(xì)胞內(nèi)的Na+-K+-ATP酶活性引起內(nèi)淋巴液離子濃度的改變，產(chǎn)生以底轉(zhuǎn)為主的膜迷路積水，進而導(dǎo)致高頻聽力下降[13]。這種聽力改變可能與內(nèi)淋巴超壓影響耳蝸毛細(xì)胞的功能有關(guān)[15,21]。實驗中腹腔注射醛固酮可使豚鼠耳蝸發(fā)生膜迷路積水，聽閾增高，與文獻(xiàn)報道一致[17]。

針灸局部穴位，可通過神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的釋放，改善內(nèi)分泌功能。三種不同穴位刺激方法作用于百會、聽宮減輕醛固酮引起的膜迷路積水，可能與其對醛固酮分泌的良性調(diào)節(jié)有關(guān)。另外，還可能與其改善迷路動脈供血，調(diào)整迷路血液循環(huán)[19]，改善代謝功能，促使內(nèi)耳膜迷路水腫吸收[10]有關(guān)。與傳統(tǒng)針灸療法相比，電針一方面使脈沖電和針刺同時作用于穴位，通過經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)，氣至病所而起作用；另一方面利用對神經(jīng)干的電刺激，激發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)的一系列反射來達(dá)到治療作用。此外，電針與針刺、艾灸在神經(jīng)傳導(dǎo)通路，對神經(jīng)遞質(zhì)以及免疫分子的影響方面也存在差異[22]。這些因素均有可能產(chǎn)生三種穴位刺激方法對膜迷路積水治療效果上的差異。實驗中電針在減輕豚鼠膜迷路積水方面表現(xiàn)出最好的效應(yīng)，優(yōu)于艾灸、針刺；艾灸優(yōu)于針刺。

波動性聽力改變是MD常見的臨床表現(xiàn)，即聽力隨膜迷路積水的改變而改變，積水增加時聽力減退，積水減輕時聽力水平增進[20]。動物實驗中，研究者也發(fā)現(xiàn)積水程度與聽力改變之間具有一定相關(guān)性[15,21]。實驗結(jié)果顯示，針刺、艾灸、電針刺激百會、聽宮均能改善豚鼠聽力，且對聽力的改善與對膜迷路積水的改善表現(xiàn)出一致的優(yōu)效關(guān)系。這可能與其緩解膜迷路積水程度，降低內(nèi)淋巴壓力，從而減輕對耳蝸毛細(xì)胞的機械刺激有關(guān)。此外，有研究表明，針灸可提高大腦皮層聽覺中樞興奮性，增強大腦皮層對聲音感受的代償力，從而實現(xiàn)對殘存聽力的充分利用[23]。也有資料表明，機體內(nèi)的許多內(nèi)分泌激素和神經(jīng)遞質(zhì)可以調(diào)節(jié)內(nèi)耳功能[24，25]，因此針灸通過神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫調(diào)節(jié)途徑調(diào)節(jié)機體激素的分泌來促進內(nèi)耳功能恢復(fù)的可能性也是存在的。而關(guān)于針刺、艾灸、電針如何減輕膜迷路積水，改善耳蝸聽功能，其具體機制值得深入探討。

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〔修回日期〕2014-10-21