黃連解毒湯對小鼠酒精性脂肪肝的預防作用

研究報告

黃連解毒湯對小鼠酒精性脂肪肝的預防作用

王睿林1，李曉娟2，白云峰1，王立福1，李蓓2，李永綱1，李瑞生2

(1. 解放軍第302醫院中西醫結合肝病診療與研究中心，北京100039；

2. 解放軍第302醫院實驗技術研究保障中心，北京100039)

【摘要】目的研究黃連解毒湯(HLJDT)對小鼠酒精性肝損傷的預防作用，為黃連解毒湯臨床防治酒精性肝病提供實驗依據。方法選取60只C57小鼠隨機分為空白對照組、模型對照組和HLJDT低、中、高劑量(0.61、1.22、2.44 g/kg/d)模型組，每組各12只。模型組用50%乙醇灌胃，同時采用HLJDT進行實驗干預，6周后，對各組小鼠的體質量、肝指數、血清生化指標以及肝臟和結腸的病理學改變進行綜合對比分析。結果HLJDT各劑量模型組小鼠的體重增長量均顯著增加(P<0.05)，肝指數明顯降低(P<0.05)，同時HLJDT各劑量模型組能顯著降低血清ALT、AST和TG的含量(P<0.05)。病理結果顯示HLJDT各劑量均對酒精性肝損傷有顯著的改善作用，且從低劑量到高劑量組對腸粘膜通透性具有遞增的改善作用。結論黃連解毒湯可顯著降低腸粘膜的通透性，對小鼠酒精性肝損傷具有一定的預防保護作用。

【關鍵詞】黃連解毒湯；酒精性脂肪肝；小鼠

[基金項目]解放軍第302醫院院長創新基金(YNKT2013026)。

[作者簡介]王睿林(1979-)，男，博士，主治醫師，從事中西醫結合治療研究，E-mail： wrl7905@163.com；李曉娟(1980-)，女，碩士，E-mail： sxlily55@163.com。并列為第一作者。

[通訊作者]李瑞生(1969-)，男，博士，副研究員，從事人類疾病動物模型研究，E-mail： lrsheng@sohu.com；李永綱(1965-)，男，碩士，主任醫師，從事傳染病學研究，E-mail： lyg100039@sina.com。

【中圖分類號】R33【文獻標識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.009

Preventive effects of Huanglian Jiedu Decoction on

alcoholic fatty liver in mice

WANG Rui-lin1，LI Xiao-juan2，BAI Yun-feng1，WANG Li-fu1，LI Bei2，LI Yong-gang1，LI Rui-sheng2

(1. Liver Disease Center for Combined TCM and Western Medicine，

2. Research and Technology Service Center，302 Hospital of PLA，Beijing 100039，China)

Abstract【】ObjectiveTo study the preventive effect of a Chinese traditional medicine, Huanglian Jiedu Decoction (HLJDT), on alcoholic fatty liver in mice, and provide experimental evidence for clinical prevention and treatment of alcoholic liver disease. Methods Sixty healthy SPF male C57 mice were randomly divided into control group, model group and low, medium and high dose HLJDT(0.61, 1.22, 2.44 g/kg/d)groups, 12 mice in each group. The mice of model groups were given gastric gavage of 50% ethanol, combined with concomitant HLJDT intervention for 6 weeks. The mice of control group received the same volume of saline. The body weight, liver index, serum biochemical indexes were determined and histopathological changes in the liver and colon tissues were examined and analyzed at 6 weeks after the experiment. ResultsBody weight gains of the mice in all the three dose HLJDT groups were significantly higher than that of the control group (P<0.05)，liver index and the serum ALT, AST and TG contents were significantly decreased (P<0.05 for all). Histological changes in the liver of all the three dose HLJDT groups were significantly milder than those of the model control group, and also improving of the colon mucosal alterations was observed in the three dose HLJDT groups in a dose-dependent manner. ConclusionsHuanglian Jiedu Decoction can well reduce the permeability of intestinal mucosa, and exerts certain preventive and protective effects on alcoholic liver injury in mice.

【Key words】Huanglian Jiedu decoction; Alcoholic fatty liver; Mice

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是一種進行性發展且后期會嚴重危害身體健康甚至威脅生命的消化系統疾病。其致病因素單一而明確，主要是長期大量飲酒所造成的，但其發病機制卻十分復雜[1]。近年來酒精致腸粘膜通透性增加，腸道內毒素滲漏入血及其激活肝Kupffer細胞產生炎癥細胞因子機制，是酒精性肝損傷機理研究的熱點之一[2,3]。而黃連解毒湯(HLJDT)是由黃連、黃柏、黃芩、桅子四味藥組成的清熱解毒的代表方，具有瀉火解毒之功效，主治實熱火毒，三焦熱盛之證[4]。目前國內研究證實黃連解毒湯具有抗內毒素、抗肝損傷、抗炎、抗氧化及降血脂等生物活性的作用[5]，但將黃連解毒湯用于干預小鼠酒精性肝損傷的研究國內外還尚未見報道。因此本實驗通過黃連解毒湯對酒精性肝損傷小鼠體質量、肝指數、生化指標以及肝臟和結腸組織病理學結果的影響，來探討黃連解毒湯對酒精性肝損傷的干預作用，以期為酒精性肝病的預防和臨床治療提供新的思路。

1材料和方法

1.1實驗動物

選擇SPF級C57小鼠，60只，雄性，單鼠體質量為(20～22)g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，生產許可證【SCXK(軍)2012-0004】。在302醫院SPF級動物實驗室內完成，其使用許可證【SYXK(軍)2012-0010】。

1.2實驗試劑

乙醇(分析純，純度>99.7%)(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20130315)；生理鹽水(解放軍第302醫院制劑室提供，批號：130527405，石家莊四藥有限公司)；黃連解毒湯顆粒由解放軍302醫院藥劑室制備。

1.3實驗分組與灌胃劑量

60只C57小鼠，隨機分為空白對照組、模型對照組、黃連解毒湯顆粒高劑量組(2.44 g/Kg)、中劑量組(1.22 g/kg)、低劑量組(0.61 g/kg)等五組，每組各12只。黃連解毒湯的劑量根據人臨床劑量換算，換算公式：小鼠劑量(g/kg)=9.1 × 人臨床劑量(0.067 g/kg)。此劑量作為低劑量，中劑量與高劑量分別為低劑量的2倍和4倍。每日不同劑量模型組灌服不同劑量的黃連解毒湯，對照組采用相同劑量的生理鹽水灌胃，30 min后[6]，空白對照組灌服生理鹽水，其他組灌服50%乙醇，劑量為12 mL/kg，連續灌服6周[7]。且根據每周體重的變化來調整黃連解毒湯和乙醇的灌胃量。

1.4檢測指標及方法

每天觀察各實驗組小鼠的活動情況，采血前禁食12 h后，經小鼠眶后靜脈叢采血，離心后取血清檢測各組小鼠的丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉移酶(AST)和甘油三酯(TG) 等三個生化指標。然后再迅速取各組小鼠的肝臟組織，稱重，并計算其肝指數=肝質量(g)/體質量(g) × 100%；同時再采集所有小鼠同一部位的肝組織和一段結腸組織，用4%的甲醛固定，HE染色后，分析各組小鼠肝臟和結腸組織的病理學檢測結果。

1.5統計學方法

利用SPSS 17.0軟件的方差分析方法對各組小鼠的檢測指標進行統計學分析，以P<0.05為差異顯著性。

2結果

2.1各組小鼠體重增長量、肝指數及生化指標的分析

通過對各組小鼠體重增長量、肝指數和生化指標的對比分析顯示：與空白對照組相比，模型組小鼠的體重增長量顯著降低(P<0.05)，肝指數顯著增加(P<0.05)，血清ALT、AST和TG也顯著增高(P<0.05)；而與模型對照組相比，HLJDT各劑量組小鼠的體重增長量均顯著增加(P<0.05)，肝指數明顯降低(P<0.05)，血清ALT、AST和TG含量明顯降低(P<0.05)，其中HLJDT對ALT和TG含量的影響呈現出劑量依賴性(表1)。

表1　各組小鼠體重增長量、肝指數和生化指標分析

注：與空白對照組相比*P<0.05；與模型對照組相比△P<0.05。

Note.*P<0.05, compared with the control group；△P<0.05, compared with the model group.

2.2各組小鼠肝臟病理學分析

空白對照組小鼠的肝小葉結構清晰，肝索排列規則且以中心靜脈放射排列，匯管區未見炎癥細胞浸潤。模型對照組小鼠肝小葉界限模糊，肝細胞內有成堆的脂肪滴，呈典型的酒精性脂肪病變。而灌服黃連解毒湯各劑量模型組小鼠的脂肪變和肝細胞腫脹程度均比模型對照組明顯減輕，各劑量組小鼠肝細胞均觀察不到成堆的脂肪滴出現，肝小葉及匯管區未見炎性細胞浸潤(圖1，見文后彩插8)。

2.3各組小鼠結腸病理學分析

結腸病理學結果顯示：空白對照組小鼠結腸粘膜層次清晰，表面光滑、整齊，粘膜上皮和腺體結構完整，上皮細胞與固有層間緊密連結；模型對照組小鼠結腸粘膜上皮細胞脫落，上皮細胞與固有層間距顯著增寬，腺體結構破壞，隱窩變淺，粘膜下層水腫；而灌服黃連解毒湯模型組從低劑量到高劑量，其腸粘膜層次較模型對照組清晰，上皮細胞與固有層間距從疏散變為緊密連結，結腸粘膜層次漸變清晰，且表面漸變整齊光滑(圖2，見文后彩插8)。

3討論

酒精性肝病的發生是一個復雜的病理生理過程，涉及多種細胞(中性粒細胞、上皮細胞和Kupffer細胞等)和多種有害因子(內毒素、氧化應激和細胞因子等)[8]。眾所周知，內毒素(LPS)是腸道革蘭陰性桿菌細胞壁的脂多糖，具有高度的免疫活性并能誘導大量炎性介質產生[9]。研究發現乙醇可導致腸道血管通透性增加，使內毒素腸滲漏入血，轉運至肝臟與Kupffer細胞相互作用，激活細胞內的多種細胞因子從而引起肝細胞凋亡[10]。因此內毒素血癥和內毒素介導的肝細胞損害在酒精性肝病的發病機理中發揮了關鍵性作用[11]。聶嬌等[12]也發現在小鼠酒精性肝病造模過程中腸粘膜通透性增加，從而加劇了肝臟的損傷程度。而方志紅等[13]研究發現健脾理氣活血方在大鼠體內能夠通過降低腸粘膜通透性，從而影響內毒素滲漏而對酒精性肝損傷發揮干預作用。而國內尚未見有關黃連解毒湯是否能夠通過抑制腸粘膜通透性而發揮抗內毒素作用，從而對酒精性肝病發揮干預作用的報道。

因此本實驗應用黃連解毒湯對酒精中毒小鼠干預6周觀察其抗酒精性肝損傷的作用，各組小鼠體重增長量和肝指數以及生化指標結果顯示：黃連解毒湯各劑量組結果與模型對照組相比，小鼠體重增長量顯著增加(P<0.05)，肝指數顯著降低(P<0.05)，血清ALT、AST和TG含量均顯著降低(P<0.05)，說明了黃連解毒湯能夠顯著改善酒精中毒小鼠的食欲，增強腸道營養吸收功能，能夠顯著降低血清轉氨酶的濃度，具有較強的修復酒精性肝臟損傷的效應；同時黃連解毒湯各組能夠顯著降低血清TG的含量，此結果與其具有抗血脂的結果相一致[14]。而肝臟病理學檢查是判斷肝臟損傷的金標準[15]，本實驗肝臟病理學結果顯示三種劑量的黃連解毒湯對酒精性肝損傷均具有顯著地改善作用，但不具有顯著的劑量依從性，與生化指標的劑量依從性不具有一致性，可能是由于肝臟病理改變與生化指標變化的靈敏度不同造成的。由于腸道革蘭氏陰性桿菌多存在于大腸部位，因此本實驗選擇觀察結腸通透性的病理學改變，結腸病理學結果顯示模型對照組小鼠結腸粘膜上皮細胞與固有層間距增寬，腺體結構破壞，說明了酒精進入體內蓄積可誘發腸粘膜的損傷，而黃連解毒湯從低劑量到高劑量對腸粘膜具有遞增的改善和保護作用，可推斷黃連解毒湯通過降低腸粘膜的通透性而影響了內毒素的吸收，對酒精性肝損傷出現的脂肪變性具有抑制和減緩發展的作用，從而發揮抗酒精性肝損傷的效應，而血清內毒素的測定以及黃連解毒湯對酒精性脂肪肝的其它作用機制還有待進一步深入研究和證實。

綜上所述，本實驗初步驗證了黃連解毒湯可顯著通過降低腸粘膜通透性從而可能會影響內毒素的吸收，對小鼠酒精性肝損傷具有一定的預防保護作用，為今后深入研究黃連解毒湯及其有效成分的藥理學作用，以及在臨床上治療ALD疾病具有十分重要的意義。

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〔修回日期〕2014-12-09