培育顆粒對人絨毛滋養細胞侵襲與增殖的作用

培育顆粒對人絨毛滋養細胞侵襲與增殖的作用

王婧瑤1，孫麗萍1*，趙丕文1，梁欣韞2*

(1.北京中醫藥大學人體機能系，北京 100029；2.首都醫科大學附屬北京婦產醫院中醫科，北京 100026)

摘要：目的觀察培育顆粒對人絨毛滋養細胞的侵襲和增殖功能的影響。方法取人妊娠5～10周正常胎盤絨毛,進行滋養細胞培養。正常23～25 d雌性SD大鼠藥物灌胃，取藥理血清。培養液加20%血清，分組培養48 h后檢測指標。用Transwell侵襲實驗檢測培育顆粒對滋養細胞侵襲功能的影響，MTT法檢測培育顆粒對滋養細胞增殖能力的影響,流式細胞術檢測培育顆粒對滋養細胞增殖核抗原(PCNA)表達的影響。結果Transwell侵襲實驗檢測結果表明,培育顆粒血清各劑量組與正常組侵襲細胞數均有差異,中劑量組侵襲細胞數最多。MTT法檢測結果表明，培育顆粒血清各劑量組與正常組吸光度均有差異,中劑量組吸光度最高。流式細胞術檢測結果表明，培育顆粒血清各劑量組與正常組PCNA陽性率均有差異，中劑量組PCNA陽性率最高。結論培育顆粒可促進人絨毛滋養細胞侵襲與增殖功能，可能與負反饋調節有關。

關鍵詞：培育顆粒；侵襲；增殖；滋養細胞；負反饋調節

DOI::10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.07.022

中圖分類號：R714.21文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)07-0719-04

基金項目:國家自然科學基金青年

作者簡介:王婧瑤(1987-)，女，碩士研究生，主要從事中醫藥與生殖研究。

*通信作者:孫麗萍，電話-13681179069,電子信箱-slp201070@163.com

梁欣韞，電話-(010)52276423,電子信箱-fredalxy@163.com

Influence of the Peiyu particles on invasion and proliferation of human trophoblast cell

WANG Jingyao1,SUN Liping1*,ZHAO Piwen1,LIANG Xinyun2*

(1.Function of Human Body Department Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;

2.TCM Department Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital of Capital Medical University,Beijing 100026,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the Effect of the Peiyu particles on invasion and proliferation capabilities of human trophoblast cell.MethodsPlacental villi from normal pregnancy of 5 to 10 weeks were taken to culture trophoblast cells.Twenty percent pharmacological serum obtained from Peiyu particles-administered normal female SD rats (aged 23 to 25 days) was added in nutrient solution for culture.After being divided into groups,trophoblast cells were cultured for 48 hours.Then,invasion cell number,absorbance and PCNA expression rate of trophoblast cell in all groups were analyzed by TW invasion assay,MTT assay,and flow cytometry,respectively.ResultsTW assay results show that invasion cell number of each dose group of Peiyu particles is different from that of the normal group,and the invasion cell number of medium dose group is the highest.MTT assay results show that each dose group of Peiyu particles is different from the normal group in absorbance with absorbance of medium dose group being the highest.Flow cytometry results also show that there are differences between each dose group of Peiyu particles and the normal group in PCNA expression rate,and the PCNA expression rate of medium dose group is the highest.ConclusionPeiyu particles can enhance invasion and proliferation abilities of human trophoblast cell,and its effect may be dose-dependent.

Keywords:Peiyu particles;invasion;proliferation；trophoblast cell;negative feedback to adjust

中醫認為早孕期間自然流產主要由于腎氣不足，胎失所系，脾氣虛弱，胎失所養，臨床辨證以腎虛和脾腎兩虛多見。培育顆粒由北京婦產醫院趙松泉研制，組方包括桑寄生、菟絲子等補腎益精藥，山藥、黃精等健脾益氣藥，熟地黃、生地黃等滋陰養血藥。全方補養腎氣，健運脾氣，滋陰養血，達到固胎的目的。前期臨床實驗已證實培育顆粒對脾腎兩虛型早期先兆流產有較好的保胎作用[1]。人絨毛滋養細胞的侵襲與增殖功能是妊娠早期成功的關鍵，自然流產的發生常與絨毛滋養細胞侵襲和增殖功能不足有關。本實驗研究培育顆粒對人絨毛滋養細胞的作用。

1實驗材料

1.1試劑和耗材DMEM F12培養液、DPBS、抗PCNA熒光標記抗體(invitrogen)，2.5%胰蛋白酶儲存液、Triton X-100、30%H2O2(biotopped)，Hank’s液、PBS緩沖液、DAB顯色試劑(Solarbio)，膠原酶Ⅰ(Gene-bio)，免疫組化試劑盒(博士德)，抗角蛋白7單克隆抗體(Epitomics)，抗波形蛋白單克隆抗體(中杉金橋)，基質膠(BD)，DMSO(Amresco)，MTT(Sigma)，胎牛血清(EX cell)。Transwell-24膜嵌套TW小室(Corning)。

1.2動物23～25 d雌性SD大鼠，斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司。許可證號：SCXK(京)2011-0004。

1.3藥物培育顆粒，首都醫科大學北京婦產醫院制劑，北京世紀壇醫院配制加工。地屈孕酮(達芙通)：雅培生產。

1.4儀器CO2培養箱(SANYO，MCO-18AIC)，超凈工作臺(北京亞泰隆實驗技術中心，022-2522)，低溫離心機(SIGMA，3K15)，倒置顯微鏡(NIKON，TS100)，多功能熒光酶標儀(TECAN，SAFIRE2)，流式細胞儀(BD，FACS Canto II)。

2實驗方法

2.1細胞培養取孕5～10周人工流產的正常胚胎的胎盤組織，洗凈血跡,收集絨毛并剪碎。用含有1%膠原酶Ⅰ和0.25%胰蛋白酶的Hank’s液消化，37 ℃，15 min，用與液消化同體積的20%胎牛血清的DMEN F12培養液終止消化，1 800 r/min室溫離心15 min,棄上清。20%胎牛血清的DMEN F12培養液制備制成細胞懸液，調整濃度為1 000～10 000 mL接種于培養皿中，37 ℃，5%CO2培養。24 h后觀察，部分細胞貼壁。

2.2滋養細胞純度鑒定吸盡培養液，Hank’s液清洗。加入4%多聚甲醛的溶液,固定48 h，PBS漂洗。0.5%Triton X-100 (DPBS新鮮配制)，室溫20 min，PBS漂洗。3%H2O2(蒸餾水新鮮配制)，室溫15 min，DPBS漂洗。免疫組化試劑盒中的血清封閉液，37 ℃，20 min,甩干封閉液。分別用含有鼠抗人細胞角蛋白7單克隆抗體和含有鼠抗人細胞波形蛋白單克隆抗體的一抗血清封閉液封閉，37 ℃，2 h，PBS漂洗。試劑盒中的生物素化孵育，37 ℃，20 min，PBS漂洗。SABC孵育，37 ℃，20 min，PBS漂洗。DAB顯色試劑1、2各50 μL，溶于900 μL PBS，避光顯色15 min，自來水沖洗。

2.3制備藥理血清將大鼠分組灌胃，地屈孕酮組，每次3 mg/kg。高劑量組，每次8 g/kg。中劑量組，每次4 g/kg。低劑量組，每次2 g/kg。對照組，蒸餾水，每次0.3 mL。每12 h灌胃1次，2次/d，3 d，第4天1次給全天量。1 h后取血，靜置1 h，3 000 r/min，離心10 min，取血清。0.22 μm微孔濾膜的一次性過濾器過濾除菌，分裝后-20 ℃保存。

2.4細胞分組培養取同一批傳代、相同密度、相同大小培養皿培養的細胞6組，吸盡20%胎牛血清DMEM F12培養液，Hank’s液清洗，加入無血清的DMEM F12培養液，培養12 h。其中5組分別加入20%大劑量組血清、20%中劑量組血清、20%小劑量組血清、20%地屈孕酮組血清、20%正常組血清，繼續培養48 h。

2.5Transwell小室侵襲實驗在上室底鋪基質膜，下室藥理血清濃度為20%，上室藥理血清濃度為15%，以保證藥理血清對細胞的營養和特定作用，使下室細胞貼壁,用5%的血清濃度差保證細胞向營養高的下室侵襲。作用48 h后，對下室與培養孔內的細胞計數。

2.6MTT法檢測培育顆粒對人絨毛滋養細胞增殖活力的影響將細胞懸液接種于96孔培養板，37 ℃、5%CO2培養，至細胞全部貼壁。吸盡細胞液，Hank’s液清洗，加入無血清DMEM F12培養12 h。用各藥理血清分組處理，繼續培養48 h。加20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續孵育4 h。吸盡培養液，每孔加150 μL DMSO，震搖10 min，使紫色結晶物完全溶解。用多功能酶標儀測定波長為490 nm時吸光值。

2.7流式細胞術檢測培育顆粒對人絨毛滋養細胞PCNA表達的影響收集細胞,PBS清洗。加入600 μL PBS，制成懸液，加入4 ℃預冷的無水乙醇1 400 μL，4 ℃固定。24 h后2 000 r/min離心15 min，棄上清，PBS清洗。加1 800 μL PBS制成細胞懸液，再加入200 μL小牛血清，37 ℃孵育30 min，PBS清洗。含1%PCNA抗體的PBS液1 mL加入離心管重懸細胞，37 ℃孵育30 min，PBS清洗。每管加入0.5 mL PBS重懸細胞，上機檢測。

3實驗結果

3.1人絨毛滋養細胞鑒定陽性細胞表面為棕黃色,陰性細胞表面無色。細胞角蛋白7染色陽性率大于90%，波形蛋白染色陰性率小于10%。表示所得細胞是絨毛滋養細胞。

3.2Transwell小室侵襲實驗檢測培育顆粒對人絨毛滋養細胞侵襲功能的影響見表1。

組 別侵襲細胞數無血清組 0±0##培育顆粒低劑量組20.7±0.6# 培育顆粒中劑量組25.7±0.6# 培育顆粒高劑量組17.0±1.0# 對照組 12.3±0.6 地屈孕酮組 31.3±5.1#

注：與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.3MTT法檢測培育顆粒對人絨毛滋養細胞增殖功能的影響見表2。

組 別吸光度/A無血清組 0.110±0.005#培育顆粒低劑量組0.504±0.003#培育顆粒中劑量組0.557±0.008#培育顆粒高劑量組0.402±0.003#對照組 0.300±0.005 地屈孕酮組 0.603±0.008#

注：與對照組比較，#P<0.05

3.4流式細胞術檢測培育顆粒對人絨毛滋養細胞PCNA表達的影響見表3。

組 別PCNA陽性率/%無血清組 4.0±0.6#培育顆粒低劑量組19.5±0.5#培育顆粒中劑量組28.2±0.4#培育顆粒高劑量組14.5±0.2#對照組 6.0±0.2 地屈孕酮組 28.3±0.4#

注：與對照組比較，#P<0.05

4討論

角蛋白是構成上皮細胞骨架的蛋白，滋養層細胞是人胚胎絨毛組織中唯一的上皮細胞，而波形蛋白是內皮細胞和間質細胞的標志蛋白，因此滋養層細胞表現為抗角蛋白染色陽性、抗波形蛋白染色陰性[2-3]。不同類型細胞的角蛋白和廣譜的細胞角蛋白沒有滋養層細胞特異性，僅抗角蛋白7抗體對細胞滋養層細胞具有特異性，而且角蛋白7是唯一的不在間質細胞中表達的角蛋白[4]。因此，滋養層細胞的純度鑒定可采用抗角蛋白7單克隆抗體和抗波形蛋白單克隆抗體來進行。本實驗角蛋白陽性細胞90%以上,鑒定表明滋養細胞培養成功。

本實驗采用血清藥理學[5]的方法研究培育顆粒組方對細胞的作用。由于中藥成分復雜，除了有效成分外，還有很多雜質，藥物的酸堿度也會對體外實驗的細胞產生影響。用含藥血清代替中藥粗提物作為藥物源，接近藥物在體內作用環境[6]。現代藥理研究表明，補腎益氣保胎中藥可提高小鼠血清孕激素含量[7]。有研究報道，補腎中藥具有提高患者血中孕酮含量的作用[8]。根據前期臨床實驗，培育顆粒可提高患者血清HCG值、孕酮值[1]。

Transwell小室的上下室間以膜孔直徑為8.0 μm的聚碳酸酯膜相隔。在聚碳酸酯膜上室側鋪一層基質膠，模仿體內的細胞外基質，上室細胞要通過聚碳酸酯膜進入營養成分較高的下室，必須先分泌基質金屬蛋白酶將基質膠溶解。計數進入下室的細胞數量，可反映細胞的侵襲能力[9]。有研究表明，補腎中藥可增強滋養細胞侵襲功能[10]。本研究中，培育顆粒各組血清對滋養細胞的侵襲均有促進作用，地屈孕酮組作用最強。培育顆粒各組中，中劑量組作用最強，高劑量組作用較中劑量組減弱，可能與負反饋調節有關。

活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶使外源性MTT還原成不溶于水的藍紫色結晶甲瓚,數量與活細胞數成正比，二甲基亞砜(DMSO)可以溶解細胞中的甲瓚。在490 nm波長處，用酶標儀測定其光吸收值(A),可間接反映活細胞的數量[11]。本研究中，培育顆粒各血清對滋養細胞的均有促進增殖作用。培育顆粒各組中，中劑量組作用最強，高劑量組作用較中劑量組減弱，可能與負反饋調節有關。

PCNA陽性的細胞率可作為細胞增殖程度的指標。有研究表明，自然流產患者滋養細胞PCNA表達降低[12-13]。本研究中，培育顆粒組各血清對滋養細胞均有促使PCNA表達增加的作用。培育顆粒各組中，中劑量組作用最強，高劑量組作用較中劑量組減弱，可能與負反饋調節導致體內相關活性物質減少有關。本研究表明，培育顆粒可通過增強人絨毛滋養細胞的侵襲與增殖能力，對防治妊娠早期自然流產起到一定的作用，其機制除提高患者血清HCG值、孕酮值，可能還與體內其他途徑相關。