胰腺癌細胞中miR-27a靶基因的確定及其意義

·短篇論著·

胰腺癌細胞中miR-27a靶基因的確定及其意義

王慧玲侯寶華區金銳

MicroRNA(miRNA)通過作用于靶基因在腫瘤的發病機制中發揮著癌基因和抑癌基因作用[1-2]。靶基因的預測與鑒定對于腫瘤發病機制的研究有著重要意義。胰腺癌的發生、發展與miRNA的關系密切，有研究報道，胰腺癌組織中的miR-27a明顯高表達[3]。本研究結合生物信息學軟件，篩選并驗證胰腺癌中miR-27a可能的靶基因。

一、材料與方法

1．細胞株及載體：人胰腺癌PANC1細胞系和HEK293T細胞均取自廣東省人民醫院腫瘤中心實驗室，常規培養傳代。pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體購自Promega公司。

2．含靶基因質粒的構建與鑒定：采用生物信息學預測軟件Targetscan和miRanda分別對miR-27a進行靶基因預測，并且結合差異表達的蛋白質，選擇合適的靶基因。根據生物信息學預測的靶基因和miR-27a結合位點，以人類基因組DNA為模板擴增SMAD4的3′UTR的部分序列，利用DNAclub設計引物序列，在引物中引入XhoⅠ和SalⅠ酶切位點和保護堿基。引物序列上游為5′-TGTCTCGAGAGACCATCCTAGAAACCAC-3′，下游為5′-TGTGTCGACGATCATACCACTGCACTCC-3′。PCR引物由上海英駿生物技術有限公司合成。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證，目的條帶用DNA膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)純化回收。根據之前設計的雙酶切位點將回收的目的片段與pmirGLO載體分別經過雙酶切、連接后構建重組質粒pmirGLO-SMAD4質粒(wt)。將重組質粒轉入DH5α感受態細胞進行擴增，挑取陽性克隆37℃培養過夜后提取質粒，進行雙酶切和測序鑒定。取上述構建的重組質粒pmirGLO-SMAD4，與miR-27a結合區域第3、4、5個堿基進行定點突變，構建突變型質粒pmirGLO-SMAD4(mut)，按賽百盛堿基突變試劑盒說明書操作，并測序鑒定。

3．細胞轉染及雙熒光素酶活性檢測：取對數生長期HEK293T細胞，以每孔4×105個細胞接種于24孔板中，培養24 h后(細胞融合度達到60%)分別將miR-27a mimic、陰性對照的miRNA-NC(上海吉瑪制藥技術有限公司)與pmirGLO-SMAD4質粒(wt)/(mut)共轉染細胞，按X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent試劑盒(TaKaRa公司)

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.02.017

基金項目：衛生公益性行業科研專項經費項目(201202007)

作者單位：510080廣州，廣東省人民醫院普通外科，廣東省醫學科學院

通信作者：區金銳，Email: whlhandsome@163.com

說明書操作。培養36 h后收集細胞，用RIPA裂解液(Pierce公司)裂解細胞，采用熒光素酶基因報告基因檢測系統(Promega公司)通過多功能酶標儀檢測螢火蟲熒光素酶活性值(F)和海腎熒光素酶活性值(R)，熒光素酶相對活性以F/R值表示。實驗重復3次。

4．SMAD4蛋白表達檢測：將胰腺癌細胞PANC1接種于6孔板培養24 h(細胞融合度達到60%)，分別將miR-27a mimic、miRNA-NC瞬時轉染細胞。轉染72 h后，提取細胞的總蛋白。BCA法蛋白定量后，取30 μg常規行蛋白質印跡法檢測SMAD4蛋白表達，以β-actin作為內參。兔抗人SMAD4單抗(Cell Signaling Technology公司)工作濃度1∶1 000，HRP標記羊抗兔IgG(聚研生物科技有限公司)工作濃度1∶5 000。以目的條帶與內參條帶灰度值比表示蛋白相對表達量。實驗重復3次。

二、結果

1．MiR-27a靶基因結合位點預測：經TargetScan和miRanda兩種方法預測，miR-27a與SMAD4 mRNA 3′端UTR區互補結合(圖1)。經miRNA靶基因數據庫-TarBase v．5c篩查及國內外相關文獻檢索，確定SMAD4與miR-27a的關系尚未見報道。

圖1　TargetScan(1A)、miRanda(1B)生物信息學軟件預測的miR-27a與SMAD4 mRNA 3′UTR的堿基互補序列(豎線部分)

2．pmirGLO-SMAD4質粒及其突變質粒的鑒定：構建的pmirGLO-SMAD4質粒(wt)，經PCR、雙酶切及測序鑒定擴增片段序列正確(圖2)。將pmirGLO-SMAD4質粒的SMAD4 3′UTR的結合區域第3、4、5位堿基的TGT突變為ACG(圖3)，突變后的質粒送測序，證實突變成功。

3．熒光素酶活性：pmirGLO-SMAD4質粒與miR-27a共轉染細胞的熒光素酶相對活性為0.540±0.041，顯著低于與miR-NC共轉染細胞的1.147±0.089，差異有統計學意義(t=6.154，P=0.003)。突變型pmirGLO-SMAD4質粒與miR-27a共轉染細胞的熒光素酶相對活性為1.097±0.018，它與miR-NC 共轉染細胞的熒光素酶活性1.111±0.058的差異無統計學意義(t=0.238，P=0.82)。

圖2　PCR 產物(2)及雙酶切產物(3)的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3　突變型pmirGLO-SMAD4質粒的突變堿基序列(下劃線標注)

4．MiR-27a轉染對PANC1細胞SMAD4蛋白表達的影響：轉染miR-27a的PANC1細胞的SMAD4蛋白表達顯著下調(圖4)。

圖4　轉染miR-NC(1)及轉染miR-27a(2)的PANC1細胞的SMAD4蛋白表達

討論MiRNA是非編碼RNA，作為轉錄后水平的調節分子作用于靶基因，促進mRNA的降解或抑制翻譯，從而抑制靶基因的表達。大量研究表明[4-6]，多數腫瘤存在miRNA表達譜的改變，胰腺癌同樣也存在這一現象[5-6]，因此研究miRNA在胰腺癌發病機制中的作用具有重要意義。

根據前期篩查實驗的結果[3]，并結合文獻報道，本研究選擇了在胰腺癌組織中明顯上調的miR-27a作為研究對象。結果顯示，含SMAD4質粒與miR-27a共轉染細胞的熒光素酶活性明顯降低，轉染miR-27a的PANC1細胞的SMAD4蛋白表達顯著下調，證實miR-27a為SMAD4的靶基因，且對SMAD4進行靶向負調控。

SMAD4位于TGF-β信號通路的中樞位置，是TGF-β/SMAD通路的關鍵應答分子，與腫瘤的發生、發展有密切關系[7-8]。SMAD4在消化道腫瘤尤其是胰腺癌中的突變率和缺失率最高。Hahn等[9]報道了胰腺癌組織中SMAD4同源缺失或突變現象，認為這種缺失或突變是癌前病變進展為胰腺癌的關鍵因素，并且是胰腺癌診斷中的一個重要標志物。另一文獻[10]通過動物實驗證實SMAD4會加速胰腺癌的發生發展。此外，臨床資料也表明，SMAD4與腫瘤臨床病理特征及患者預后密切相關[11-12]。

參考文獻

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收稿日期：(2014-12-11)

(本文編輯：呂芳萍)