轉基因HBV小鼠急性肝損傷的生物學特性研究

轉基因HBV小鼠急性肝損傷的生物學特性研究

魏琴1,2， 姜濤2， 苗娜3， 張春2， 李志強2， 壽璽2， 馬嵋2， 丁劍冰1

(新疆醫科大學1基礎醫學院免疫學教研室， 烏魯木齊830011；2第一附屬醫院新疆醫學模型動物研究重點實驗室；

3第一附屬醫院病理科， 烏魯木齊830054)

摘要:目的研究四氯化碳(CCL4)誘導轉基因乙型肝炎病毒(HBV)小鼠急性肝損傷的生物學特性的改變。方法選取32只健康雄性C57BL/6小鼠作為空白對照組，實驗組：選用32只健康雄性C57BL/6小鼠作為CCL4干預組，32只健康雄性HBsAg表達陽性C57BL/6-HBV轉基因小鼠為HBV+CCL4干預組。空白對照組按0.5 mL/kg腹腔注射橄欖油溶液，于0、24、48、72 h 4個時間點取標本。實驗組每組各留8只作為空白對照，均按0.5 mL/kg腹腔注射橄欖油溶液，0 h處死；其余24只各自隨機分組，一次性給予0.5 mL/kg腹腔注射10%CCL4橄欖油溶液，分別于24、48、72 h每組隨機挑選8只小鼠，采集標本，全血用于計數白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血小板(PLT)，取血清測定天冬氨酸轉氨酶(AST)、丙氨酸轉氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)。結果與空白對照組比較，CCL4干預組24 h AST、ALT明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；HBV+CCL4干預組與CCL4干預組相比，AST、ALT水平在損傷24 h達到峰值，且差異有統計學意義(P<0.01)； CCL4干預組和HBV+CCL4干預組24 h時WBC均呈現下降，且兩組差異有統計學意義(P<0.05)；HBV+CCL4干預組RBC在24、48、72 h均降低，與0 h比較差異有統計學意義(P<0.05)；HBV+CCL4干預組PLT 在48、72 h均降低，與0 h比較差異有統計學意義(P<0.05)。HBV轉基因小鼠在CCL4誘導下24 h AST、ALT顯著升高，WBC、RBC、PLT均降低；ALP、TP、ALB無明顯差異，這些指標的改變符合急性肝損傷模型的標準。結論成功建立HBV轉基因小鼠急性肝損傷模型，為進一步研究急性肝損傷的發病機制及其他變化提供了可靠的實驗平臺。

關鍵詞：HBV轉基因小鼠； 四氯化碳； 急性肝損傷；

中圖分類號：R392文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.04.013

[收稿日期：2014-12-04]

Study on the biological characteristics of HBV transgenic mice with acute liver injury

WEI Qin1,2， JiANG Tao2， MIAO Na3， ZHANG Chun2， LI Zhiqiang2， SHOU Xi2，

MA Mei2， DING Jianbing1

(1DepartmentofImmunology，BasicMedicalCollege，XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011，China;2XinjiangKeyLaboratoryofMedicalAnimalModelResearch;

3DepartmentofPathology,TheFirstAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo study the biological characteristics of acute liver injury in mice induced by transgenic hepatitis B virus (HBV) by carbon tetrachloride (CCL4). Methods32 male C57BL/6 mice were the control group; 32 male C57BL/6 mice were the CCL4 group; 32 male transgenic C57BL/6 mice with HBsAg positive expression were HBV+CCL4 group. The control group was injected intraperitoneally by 0.5 mL/kg olive oil and taken specimens at 0, 24, 48, 72 h. 8 mice in two model groups were taken as control and given 0.5 mL/kg intraperitoneal injection of olive oil solution, killed at 0 h. The other 24 mice were grouped randomly and given 0.5 mL/kg 10% CCL4 olive oil solution once to produce acute liver injury model, 8 mice among which were randomly selected for specimens at 24, 48, 72 h to detect whole blood leukocyte count (WBC), red blood cell (RBC), platelets (PLT), measured in serum aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), total protein (TP), albumin (ALB). ResultsCompared with the control group, AST and ALT in CCL4 group peaked at 24 h, with significant difference (P<0.01)； compared with the CCL4 group, AST and ALT in HBV+CCL4 group peaked at 24 h, with a significant difference (P<0.01)；WBC decreased in model groups, with a significant difference (P<0.05)；Compared with 0 h in HBV+CCL4 group; RB C in HBV+CCL4 group decreased at 24, 48, 72 h, with a significant difference (P<0.05)；Compared with 0 h in HBV+CCL4 group，PLT decreased at 48， 72 h, with a significant difference (P<0.05). At 24 h AST and ALT peaked; WBC, RBC, PLT decreased in HBV transgenic mice induced by CCL4; ALP, TP, ALB had no significant difference. All the changes were in accordance with the standard indicators of acute liver injury. Conclu-sion58The establishment of acute liver injury model in HBV transgenic mice was of feasibility and reliability for further research on pathogenesis of acute liver injury.

Key words: HBV transgenic mice; carbon tetrachloride; acute liver injury

乙型肝炎病毒(HBV)的持續存在一直嚴重影響著人類的肝臟功能，目前全球約有4億人是HBV攜帶者，全世界每年因HBV感染及其后遺癥而死亡的人數為100萬～200萬[1]。急性肝損傷又是各種嚴重肝病發生、發展的始動環節，如果不能得到及時有效的治療，很快就可轉變為慢性肝損傷，甚至是肝纖維化、肝硬化乃至肝癌。因此，肝損傷已經成為嚴重危害人類健康的重大疾病之一。已有研究對轉基因HBV小鼠基礎的生理生化指標進行分析[2-4],采用四氯化碳(CCL4)制作急性肝損傷是經典的肝損傷模型[5-6]，轉氨酶常作為衡量肝損傷的常用指標[7-9]。本研究選擇攜帶HBV病毒的轉基因小鼠作為工具鼠，利用CCL4誘導小鼠制作急性肝損傷模型，以觀察在不同時間肝臟損傷的生物學特性的改變。

1材料和方法

1.1動物及分組選取32只健康雄性C57BL/6小鼠作為空白對照組，32只健康雄性C57BL/6小鼠作為CCL4干預組(購自新疆醫科大學實驗動物中心)；另購遺傳背景相同的SPF級乙肝表面抗原(HBsAg)陽性轉基因雄性小鼠32只作為HBV+CCL4干預組(購自上海南方模式生物公司)。均為6～8 周齡,動物適應性喂養1 w。

1.2試劑及儀器HBsAg 檢測試劑盒(荷蘭 Akio nobel 公司),天冬氨酸轉氨酶(AST)、丙氨酸轉氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)血清及血常規檢測試劑(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)，AST試劑盒(批號:140213008)，ALT試劑盒(批號:140113006)，ALP試劑盒(批號:140312006)，TP試劑盒(批號:140813009)，ALB試劑盒(批號:140913009),V-53LEO(Ⅰ)溶血劑(批號：2013041401),V-53LEO(Ⅱ)溶血劑(批號：20111011),V-53LH溶血劑(批號：2013070701),V-53清潔液(批號：20120428001),四氯化碳(天津永晟精細化工有限公司，批號20121025)，橄欖油(意大利AGIA，批號4406049)。生化儀(BS-120)、五分類血球儀(BC-5300Vet)購自深圳邁瑞有限公司，顯微鏡(LM3000)購自美國Leica公司。

1.3方法

1.3.1急性肝損傷模型的制作選取32只健康雄性C57BL/6小鼠作為空白對照組，實驗組：選用32只健康雄性C57BL/6小鼠作為CCL4干預組，32只雄性HBsAg表達陽性C57BL/6-HBV轉基因小鼠為HBV+CCL4干預組，制作急性肝損傷模型。空白對照組按0.5 mL/kg腹腔注射橄欖油溶液，于0、24、48、72 h 4個時間點取標本。實驗組每組各留8只作為空白對照，均按0.5 mL/kg腹腔注射橄欖油溶液，0 h處死，其余24只各自隨機分組，一次性給予0.5 mL/kg腹腔注射 10%CCL4橄欖油溶液，分別于24、48、72 h每組隨機挑選8只小鼠，內眥靜脈取血，3 000 r/min離心5 min，取血清測定AST、ALT、ALP、TP、ALB，全血用于測定血常規。

1.3.2血液學檢查全血用EDTA-2K抗凝,混勻后用全血細胞計數儀測定白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)及血小板(PLT)。采用生化分析儀測定血清中AST、ALT、ALP、TP、ALB。

2結果

2.1肝損傷不同時期血清生化水平的改變

2.1.1肝損傷不同時期AST、ALT的變化組間比較，在24 h時， CCL4干預組AST、ALT明顯高于空白對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；在48、72 h時，HBV+CCL4干預組AST、ALT明顯高于 CCL4干預組，差異有統計學意義(P<0.05)。組內比較，空白對照組4個時間點的AST、ALT水平差異均無統計學意義。 CCL4干預組CCL4誘導24 h 時AST、ALT水平迅速升高，與0、48、72 h比較差異均有統計學意義(P<0.01)。HBV+CCL4干預組24 h AST、ALT水平迅速升高并達峰值，48 h水平仍較高，與0、72 h比較差異均有統計學意義(P<0.01)，見表1。

2.1.2肝損傷不同時期ALP、TP、ALB的變化3組動物ALP、TP、ALB在經CCL4干預后無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2肝損傷不同時期血常規指標WBC、RBC、PLT的改變

2.2.1肝損傷不同時期WBC的變化組間比較，24 h時CCL4干預組WBC明顯低于空白對照組和HBV+CCL4干預組，差異有統計學意義(P<0.05)。組內比較，空白對照組內各時間點比較差異無統計學意義(P>0.05)；24 h時CCL4干預組WBC明顯低于0、48、72 h時，差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

2.2.2肝損傷不同時期RBC的變化組內比較，HBV+CCL4干預組24 h時RBC明顯低于0 h，差異有統計學意義(P< 0.05)，RBC在不同時間點3組間差異無統計學意義(P>0.05),見表2。

2.2.3肝損傷不同時期PLT的變化組間比較，24 h時HBV+CCL4干預組PLT明顯高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。 組內比較，HBV+CCL4干預組，24 h PLT明顯高于48、72 h，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表1　3組動物AST、ALT、ALP的比較( ±s， U/L)

注：與空白對照組比較， *P<0.05； 與CCL 4干預組比較， △P<0.05； 與本組24 h比較， ★P<0.05。

注：與空白對照組比較，*P<0.05； 與CCL4干預組比較，△P<0.05； 與本組24 h比較，★P<0.05。

3討論

正常情況下，大多數免疫功能正常的成人急性感染 HBV后可通過適應性免疫和固有免疫應答的協調作用而得以清除，并獲得對 HBV再次感染的抵抗力，但約10%的成人HBV感染者或經母嬰垂直傳播途徑感染的人群不能有效清除病毒，導致HBV持續感染，甚至最終發展成為肝硬化或肝癌[10]。CCL4是一種典型的肝臟毒性物質，其誘導的肝損傷模型有典型的組織學、生物化學和分子學的改變[11]，CCL4致急性肝損傷模型是經典模型之一。

諸興桂[12]研究顯示，轉氨酶是作為鑒定肝臟是否損傷的標志物，其為可溶性酶。當肝細胞受到損傷時，這些酶就迅速釋放，隨之血清中轉氨酶水平升高[13]。本研究結果顯示，AST在干預24 h迅速達到峰值，且轉基因HBV小鼠組最高，提示24 h時CCL4已經造成了肝臟功能障礙；而CCL4干預組在48 h就急劇下降，而轉基因HBV小鼠從48 h開始下降至72 h仍遠高出正常水平，可能提示與小鼠攜帶的HBsAg有關，可以推斷健康小鼠因為肝功能健全，肝臟的自我修復能力很強，在48 h AST水平就降到一個低值，而轉基因小鼠AST水平始終較高，提示肝損傷仍在進行中。ALT是反映肝損傷的很靈敏的指標。本研究結果顯示，經干預24 h健康C57BL/6小鼠與未干預組小鼠相比ALT顯著升高，提示24 h時CCL4已經造成了肝臟損傷；在48 h，經CCL4干預后的健康C57BL/6小鼠組ALT迅速下降，而轉基因小鼠組仍處于較高水平，而且急性肝炎時血清ALT高低與臨床病情輕重相平行，提示肝損傷在48 h較為嚴重。ALP、TP、ALB在CCL4干預后未見明顯改變，可能是由于在早期肝損傷時ALP及蛋白水平尚未發生變化。本研究顯示，轉基因HBV小鼠WBC在0 h高于空白對照組，且差異有統計學意義(P<0.05)，經CCL4干預24 h 后3組動物WBC均降低，這完全符合動物的臨床表現，其中以CCL4干預組降幅最大，而轉基因HBV小鼠次之，這可能是由于轉基因HBV小鼠本身攜帶HBsAg以致其產生免疫耐受，反而對外來刺激反應較緩慢。轉基因HBV小鼠經CCL4干預后，24 h RBC開始降低并低于正常值下限，48 h升高，這與WBC的變化保持一致，符合動物的臨床表現。同樣轉基因HBV小鼠組經CCL4干預后，24 h PLT急劇下降并低于正常值下限，這也是符合急性肝損傷的臨床血液學改變。

總之，本研究結果表明，在CCL4干預后HBV轉基因小鼠24 h即可成功復制急性肝損傷模型，但與健康C57BL/6小鼠在CCL4干預后相比較，48 h健康小鼠轉氨酶即可迅速降低，而HBV轉基因小鼠則變化不大，這可能與HBsAg攜帶有關，導致HBV轉基因小鼠肝臟自我修復能力較差。其具體機制需要進一步實驗從病理學、分子生物學及免疫學等方面展開進一步研究。

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(本文編輯楊晨晨)