RISK信號通路在1-磷酸鞘氨醇后適應減輕心肌細胞缺氧/復氧損傷中的作用

王雨晴,吳艷娜,李　欣,尹永強,康　毅,婁建石,溫　克

(天津醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，天津　300070)

RISK信號通路在1-磷酸鞘氨醇后適應減輕心肌細胞缺氧/復氧損傷中的作用

王雨晴,吳艷娜,李欣,尹永強,康毅,婁建石,溫克

(天津醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，天津300070)

中國圖書分類號：R322.11；R329.25；R542.2；R845.22；R977.3

摘要：目的研究再灌注損傷挽救激酶(reperfusion injury salvage kinase，RISK)信號通路在1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)后適應減輕H9c2心肌細胞缺氧/復氧損傷中的作用。方法將H9c2細胞隨機分為7組，即(1)正常對照組(C)；(2)缺氧/復氧組(H/R)；(3)S1P組；(4)S1P+LY294002組(S1P+LY)；(5)LY組；(6)S1P+PD98059組(S1P+PD)；(7)PD組。采用MTT法測定各組細胞存活率；比色法測定丙二醛(MDA)含量、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活力；采用激光共聚焦顯微鏡技術檢測細胞內游離鈣離子濃度變化；流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡率；Western blot法測定Akt和ERK1/2蛋白的磷酸化水平。結果與H/R組比較，S1P組可明顯增加H9c2細胞缺氧/復氧損傷后細胞存活率及凋亡率，增加T-SOD及Mn-SOD活力，降低MDA含量，降低鈣離子濃度，增加Akt和ERK1/2磷酸化水平，而PI3K/Akt信號通路阻斷劑LY294002或ERK1/2阻斷劑PD98059可阻斷S1P對H9c2的上述作用。 結論S1P能夠減輕H9c2細胞缺氧/復氧損傷, 加入PI3K/Akt抑制劑LY294002和ERK1/2抑制劑PD98059均使S1P 的保護作用被取消，表明S1P通過RISK信號通路發揮抗H9c2細胞缺氧/復氧損傷作用。

關鍵詞:S1P；缺氧/復氧；H9c2細胞；PI3K/Akt；ERK1/2；RISK

再灌注損傷挽救激酶(reperfusion injury salvage kinase，RISK)信號通路是抗心肌缺血/再灌注損傷的主要機制，該信號通路主要包括促生存激酶磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)和細胞外信號調節蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)，兩者均為絲氨酸/蘇氨酸激酶。很多實驗已表明PI3K和ERK1/2磷酸化參與缺血預適應及藥物介導的抗心肌缺血/再灌注損傷過程[1-2]。前者激活后能夠促進下游靶蛋白內皮一氧化氮合酶(endothelial NO synthase，eNOS)、p70S6K、GSK-3β的磷酸化，從而抑制mPTP的開放而發揮保護作用[3]； ERK1/2信號通路激活能夠抑制蛋白酶caspase-3的激活，從而抑制心肌細胞凋亡。兩條信號通路的激活均能夠抑制促凋亡蛋白Bim、Bax、Bad的表達，從而使缺血心肌細胞免于壞死或凋亡[4]。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)是細胞神經鞘磷脂代謝產物之一[5]。本實驗室前期研究發現，S1P后適應抑制炎癥反應、拮抗氧化應激、保護線粒體結構功能，減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷，亦可緩解心肌細胞缺氧/復氧損傷[6-7]。上述作用是否與RISK通路有關，需進一步的實驗加以驗證。本實驗擬觀察S1P后適應對RISK通路中關鍵成分Akt和ERK1/2磷酸化的影響，以及PI3K/Akt抑制劑LY294002、ERK1/2抑制劑PD98059對S1P后適應保護作用的影響，以明確S1P后適應保護作用與RISK通路的相關性。

1材料

H9c2 心肌細胞株(中國協和醫科大學基礎醫學研究所細胞中心)；S1P(批號：032M4103V)、PI3K/Akt抑制劑(LY294002，LY)(批號：092M4616V)、ERK1/2抑制劑(PD98059，PD)(批號：MFCD00671789)均購自美國Sigma公司；Fura-3/AM(江蘇碧云天生物技術研究所，批號：20140113)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(北京嘉美生物公司，批號：4AD271211F)；anti-p-Akt(ser473)(美國Santa Cruz Biotechnology公司，批號：20131210)；anti-Akt(美國Cell Signaling Technology公司，批號：20120319)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔抗體(批號：970380)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠抗體(批號：107724)均購自北京中衫金橋生物技術有限公司； Olympus CK2 型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Model 680 型酶標儀(美國BIO-RAD 公司)；缺氧箱(美國Billups-rothenberg 公司)；FACS Calibur型流式細胞儀(美國BD 公司)；FV1000型激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)。

2方法

2.1細胞分組將培養的大鼠H9c2細胞隨機分為7組，即(1)正常(C)組：細胞在5% CO2、37℃培養箱中培養；(2)缺氧/復氧(H/R)組：細胞缺氧16 h后換用無血清的DMEM復氧培養4 h；(3)S1P組：缺氧處理16 h后，復氧前加入終濃度為4 μmol·L-1的S1P；(4)S1P+LY294002(S1P+LY)組：在復氧前加入終濃度為10 μmol·L-1的LY，處理30 min后加入S1P；(5)LY294002(LY)組：復氧前加入終濃度為10 μmol·L-1的LY；(6)S1P+PD98059(S1P+PD)組：在復氧前加入終濃度為50 μmol·L-1的PD，處理30 min后加入S1P；(7)PD98059(PD)組：復氧前加入終濃度為50 μmol·L-1的PD。

2.2模型的建立將H9c2 心肌細胞用模擬缺氧液置換正常培養液，用95% N2+5% CO2的混合氣于37℃培養箱缺氧培養16 h；再換用含藥DMEM低糖培養基在95% O2+5% CO2的正常培養條件下培養4 h，建立H/R損傷模型。

2.3測定指標

2.3.1細胞存活率正常組正常培養，其他組細胞經缺氧16 h 以及復氧4 h處理后，利用MTT法測定490 nm波長下每孔光吸收度值(OD 值)，并按下述公式計算各組細胞存活率：細胞存活率/%=(各實驗組OD值-空白對照組OD值)/(正常對照組OD值-空白對照組OD值)×100 %。

2.3.2MDA 含量、SOD 活性的檢測造模給藥處理后收集上清液，按MDA、SOD 試劑盒說明操作，比色法測定各組細胞培養液MDA 含量及SOD 活性。

2.3.3心肌細胞內鈣離子測定造模給藥處理后棄培養液，用PBS 沖洗2遍。加入500 μL含5 μmol·L-1Fluo-3 AM的PBS，37℃避光下負載40 min。PBS洗滌細胞后，避光孵育20 min。激光共聚焦顯微鏡下測定各組的熒光強度(激發波長：488 nm，發射波長：525 nm)，用Image Pro Plus軟件處理分析、計算各組的熒光強度。

2.3.4流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡百分率經處理后消化法收集細胞，采用Annexin V/PI 雙染法對凋亡細胞進行染色，流式細胞儀測定熒光強度，并以Expo32軟件處理分析、計算凋亡率。

2.3.5心肌細胞Western blot 檢測經處理后裂解細胞，BCA 法蛋白定量，將蛋白樣本進行SDS-PAGE 凝膠電泳，電轉膜法將膠中蛋白轉移至硝酸纖維素膜，封閉液室溫封閉1 h，分別加入p-Akt、t-Akt、p-ERK 1/2、t- ERK 1/2一抗，4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，加入ECL發光液1 min 顯色。經顯影、定影后測定特異性條帶光密度值，并計算磷酸化蛋白與總蛋白的比值。

3結果

3.1細胞存活率H/R組細胞存活率明顯低于正常對照組(P<0.01)。經S1P后處理后，S1P組細胞存活率明顯高于H/R組(P<0.01)。與S1P組相比，加入LY294002 或PD98059以后細胞存活率明顯降低，且與H/R組相比差異無顯著性，見Tab 1。

Tab 1Effect of S1P, LY and PD on the viability of H9c2 cells,

GroupCellviability/%MDA/nmol·L-1T-SOD/kU·L-1Mn-SOD/kU·L-1C100±0.000.85±0.09025.74±2.059.79±1.06H/R60.44±3.19**3.86±0.069**10.67±1.44**6.60±0.97**S1P73.13±1.21**##1.57±0.050**##19.46±1.31**##9.24±0.77**##S1P+LY63.41±2.74**▲▲2.94±0.072**▲▲13.60±1.46**▲▲5.01±0.61**▲▲LY53.64±2.69**3.21±0.062**13.49±1.74**4.98±0.69**S1P+PD62.64±4.54**▲▲3.04±0.097**▲▲13.54±2.53**▲▲5.11±0.64**▲▲PD54.40±1.06**3.29±0.081**12.55±1.52**5.05±0.78**

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH/R group;▲▲P<0.01vsS1P group

3.2細胞培養液中MDA含量和SOD含量與正常對照組相比，H/R組MDA含量明顯升高(P<0.01)，T-SOD、Mn-SOD活力明顯降低(P<0.01)；經S1P后處理后，S1P組的MDA含量明顯降低(P<0.01)，T-SOD、Mn-SOD活力明顯提高(P<0.01)；與S1P組相比，加入LY294002或PD98059以后，MDA含量明顯增加(P<0.01)，T-SOD、 Mn-SOD活力明顯降低(P<0.01)，且與H/R組相比差異無顯著性，見Tab 1。

3.3細胞內游離鈣離子的測定結果顯示，經過H/R損傷后，細胞內鈣離子的熒光強度明顯增強，與正常對照組相比，差異有顯著性(P<0.01)；經過S1P處理后，細胞內鈣離子的熒光強度明顯降低，且與H/R組相比，差異有顯著性(P<0.01)；加入LY294002以后，細胞內鈣離子的熒光強度明顯增強，且與S1P組相比，差異有顯著性(P<0.01)。加入PD98059以后，細胞內鈣離子的熒光強度明顯增強，且與S1P組相比，差異有顯著性(P<0.01)，見Tab 2及Fig 1。

Tab 2Effect of S1P, LY and PD on fluorescence intensity of

GroupFluorescenceintensityC0.54±0.033H/R2.77±0.110**S1P0.75±0.043**##S1P+LY1.27±0.038**▲▲LY1.55±0.036**S1P+PD1.27±0.032**▲▲PD1.88±0.023**

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH/R group;▲▲P<0.01vsS1P group

3.4細胞凋亡率測定結果表明，正常對照組細胞凋亡比較少，與正常對照組相比，H/R組細胞凋亡明顯增加(P<0.01)；經過S1P處理后的細胞凋亡率與H/R組相比明顯下降(P<0.01)；與S1P組相比，加入LY294002以后，細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)，加入PD985059以后，細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)，見Tab 3及Fig 2。

Tab 3Effect of S1P, LY and PD on the apoptotic rate

GroupApoptosisrate/%C8.53±0.38H/R28.83±1.23**S1P16.80±0.57**##S1P+LY23.46±0.91**▲▲LY28.09±0.65**S1P+PD27.60±0.83**▲▲PD38.00±0.78**

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH/R group;▲▲P<0.01vsS1P group

Fig 1　Effect of S1P, LY and PD on fluorescence intensity of intracellurar Ca2+ of H/R injury H9c2 cells by laser scanning confocal microscope

A: Control group; B: H/R group; C: S1P group; D: S1P+LY group; E: LY group; F: S1P+PD group; G: PD group

Fig 2　Effect of S1P, LY and PD on the apoptotic rate of H9c2 cells after H/R injury(n=3)

A: Control group; B: H/R group; C: S1P group; D: S1P+LY group; E: LY group; F: S1P+PD group; G: PD group

3.5p-Akt、t-Akt和p-ERK1/2、t- ERK1/2的蛋白表達變化Western blot結果顯示，各組之間t-Akt蛋白、t-ERK1/2蛋白表達差異無顯著性。與正常對照組相比，H/R處理能使p-Akt蛋白、p-ERK1/2蛋白表達明顯增加(P<0.01)；與H/R組相比，S1P組能明顯增加p-Akt蛋白、p-ERK1/2蛋白表達(P<0.01)；與S1P組相比，加入LY294002以后，p-Akt蛋白的表達明顯降低(P<0.01)，加入PD90589以后p-ERK1/2蛋白的表達明顯降低(P<0.01)，且與正常對照組相比均無明顯變化。見Fig 3、4。

Fig 3　Effect of S1P and LY on the expression of

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH/R group;▲▲P<0.01vsS1P group

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH/R group;▲▲P<0.01vsS1P group

4討論

有研究表明，心肌缺血/再灌注損傷涉及多方面因素，如氧自由基生成增多、細胞內鈣離子超載、線粒體損傷等[8]。當氧自由基的生成超過了機體內源性抗氧化系統的清除能力時，過多的氧自由基可引起脂質過氧化反應，并刺激線粒體細胞色素C的釋放，后者可進一步激活caspase-9，誘導細胞凋亡。SOD是機體重要的內源性自由基清除劑，主要包括分布于線粒體的Mn-SOD以及分布于胞質的Cu/Zn-SOD，其活性的高低可間接反映機體消除ROS的能力[9]。MDA是脂質過氧化的產物，測試MDA的含量不僅可以反映心肌細胞膜結構的脂質過氧化程度，而且可間接反映氧自由基水平及氧化應激損傷的程度[10]。本實驗發現，H/R組氧自由基增多，抗氧化能力減弱，細胞內鈣離子增加，細胞凋亡率提高；而給予S1P能減輕細胞脂質過氧化損傷、提高細胞的抗氧化能力、減輕細胞內鈣離子超載、抑制細胞凋亡。

RISK信號通路主要包括PI3K/Akt及ERK通路。PI3K/Akt通路廣泛存在于細胞中，是參與細胞生長、增殖、分化調節的信號轉導通路。ERK在正常心肌細胞中低表達，當受到I/R或者H/R的刺激時，ERK被激活并表達上調[11]。近年來研究顯示，ERK信號通路在心肌I/R或者H/R中主要是發揮保護作用[12]。作為心肌保護重要的信號傳導機制，很多研究已證實RISK信號通路在缺血預適應或后適應抗心肌缺血/再灌注損傷中的作用[12]。也有研究報道，藥理性后適應(如七氟醚、阿片受體激動劑等)可通過激動PI3K-Akt或ERK1/2發揮心肌保護作用[13-14]。然而，離體心臟灌流實驗研究報道，S1P受體激動劑FTY720k可激活Akt，促進LVDP恢復，但并沒有緩解心肌損害，減少梗死面積[15]。本研究發現，S1P在保護缺氧/復氧損傷心肌細胞的同時，亦可提高p-Akt和p-ERK1/2水平，而應用LY294002阻斷PI3K/Akt信號通路或者PD98059阻斷ERK1/2信號通路，均可明顯抑制S1P對心肌細胞的保護作用，表現為細胞存活率下降，MDA含量增加，細胞培養液中T-SOD和Mn-SOD的活性降低，細胞內鈣離子的濃度增加，細胞凋亡率增加。

綜上所述，S1P對缺氧/復氧誘導的H9c2細胞損傷的保護作用與激活RISK信號通路有關。關于S1P對其通路上下游蛋白的影響，本實驗未進行驗證，仍需進一步的研究。

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網絡出版時間：2015-1-9 13:37網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.008.html

Role of RISK signal pathway in reducing cardiomyocytes hypoxia/

reoxygenation injury induced by S1P postconditioning

WANG Yu-qing, WU Yan-na, LI Xin, YIN Yong-qiang, KANG Yi, LOU Jian-shi, WEN Ke

(DeptofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Abstract:AimTo study the protective effects of sphingosine 1-phosphate (S1P) postconditioning on rat myocardial cells injured by hypoxia/reoxygenation in reperfusion injury salvage kinase (RISK) signal pathway. MethodsThe cultured rat H9c2 cells were randomly divided into seven groups: (1) control group; (2) hypoxia/reoxygenation (H/R) group; (3) S1P group; (4) S1P+LY294002 group(S1P+LY); (5) LY group; (6) S1P+PD98059 group(S1P+PD); (7) PD group. The viability of H9c2 cells was detected using MTT method. The content of MDA in the cultured medium and the activity of T-SOD and Mn-SOD were measured with colorimetry. The concentration of intracellular free calcium ion was detected by confocal microscopy. The rate of cell apoptosis was determined by flow cytometric analysis. Western blot was used to assess phosphorylation of Akt and ERK1/2 in H9c2 cells. ResultsCompared with the H/R group, S1P significantly increased vaibility of cells, lowered the rate of apoptosis, decreased the content of MDA in the culture medium， increased the activity of T-SOD and Mn-SOD, reduced concentration of intracellular calcium and increased the phosphorylation of Akt and ERK1/2. When added LY294002 or PD98059, the effects of S1P above were inhibited. ConclusionS1P protects H9c2 cells against hypoxia/reoxygenation injury. The protection of S1P was inhibited by LY294002, the inhibitor of PI3K/Akt and PD98059, the inhibitor of ERK1/2. S1P protects H9c2 cells against hypoxia/reoxygenation injury via RISK pathway.

Key words:S1P; hypoxia/reoxygenation; H9c2 cells; PI3K/Akt; ERK1/2; RISK

通訊作者溫克(1974-)，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：心血管藥理學，,E-mail：13820883653@163.com

作者簡介：王雨晴(1991-)，女，碩士生，研究方向：心血管藥理學，E-mail: zlxxwyq@163.com;

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81173058);國家自然科學基金青年基金資助項目(No 81102446);天津市自然科學基金資助項目(No 10JCZDJC20900)

收稿日期:2014-10-08,修回日期:2014-10-31

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2015)02-0181-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.008