雙團棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4的基因克隆及活性檢測

徐學清,劉文君

(南方醫科大學藥學院，廣東 廣州　510515)

雙團棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4的基因克隆及活性檢測

徐學清,劉文君

(南方醫科大學藥學院，廣東 廣州510515)

中國圖書分類號：R-332；R341.6；R342.3；R364.3；R394.2；R977.6

摘要：目的研究雙團棘胸蛙(Nanorana yunnanensis)皮膚胸腺肽-β4的基因和促進血管生成作用。方法通過基因擴增的方法克隆出雙團棘胸蛙的2個皮膚胸腺肽-β4(pTβ4-1和pTβ4-2)的cDNA；根據推導蛋白序列合成多肽在雞胚尿囊膜和內皮細胞實驗系統進行血管生成活性分析。結果pTβ4-1和pTβ4-2的cDNA長度分別為662 bp和673 bp，開放閱讀框都為135 bp，編碼44個氨基酸殘基。成熟蛋白擁有四足動物胸腺肽β4的典型特征。pTβ4-1和pTβ4-2的cDNA序列及成熟蛋白與來源于人類、家鼠、家雞、爪蟾、斑馬魚、大比目魚和棕點湍蛙的胸腺肽-β4高度相似；合成的pTβ4-1和pTβ4-2都能促進雞胚尿囊膜血管生長和內皮細胞小管形成。結論雙團棘胸蛙皮膚含有兩個具有促血管生成的胸腺肽-β4。

關鍵詞：雙團棘胸蛙；胸腺肽-β4；皮膚；cDNA序列；兩棲動物；雞胚絨毛尿囊膜；人血管內皮細胞胸腺肽-β4在自然界中廣泛存在。最初被推測具有胸腺激素的功能[1]，隨后的研究發現，他們可以阻隔G-肌動蛋白的聚合，調節G-肌動蛋白形成細胞骨架。此外，胸腺肽-β4在加快傷口愈合、促進心血管生成、保護心臟、治療腫瘤、延緩內皮細胞衰老、促進頭發毛囊發育、抗微生物和抗炎等多方面都有作用[2-3]。因此，它們是很有應用潛力的一類多肽。目前，相關多肽已進入治療慢性損傷和急性心肌梗死的一期臨床評估[4]。

兩棲動物在適應水陸兩種類型生存環境的過程中，在皮膚中進化形成了許多具有藥理活性的防御分子，如抗菌肽、胰島素釋放肽、類鴉片活性肽、親肌肉肽和胸腺肽-β4等，但作為重要的防御分子的胸腺肽-β4目前僅在棕點湍蛙和蟾蜍被報到[5-6]。在本研究中，我們報道了雙團棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4的基因和促血管生成作用。這為治療傷口愈合和缺氧性相關疾病提供了新的候選藥物分子，并為研究物種進化提供證據。現將結果報道如下：

1材料與方法

1.1材料體重35~72 g的成年雙團棘胸蛙(Nanoranayunnanensis)采自云南昆明；10 日齡受精雞胚購自華南農業大學；TRIzol溶液為美國Invitrogen公司產品；cDNA文庫構建試劑盒來自CLONTECH公司；pMD-18T載體克隆試劑盒、Taq酶及相關試劑為TaKaRa產品；膠回收試劑盒來自PROMEGA公司；重組人堿性成纖維細胞生長因子(rh-bFGF)來自北京雙鷺藥業股份有限公司(批號：20041212)；定性濾紙為英國Whatman公司產品(批號：002090)；RPMI 1640培養基、胰酶、小牛血清均來自Gibco公司；BD BiocoatTM血管生長板來自BD Biosciences公司；MTT檢測試劑盒來自建成生物工程研究所；其他試劑均為國產分析純。

1.2方法

1.2.1目標片段擴增以棕點湍蛙和哺乳動物胸腺肽-β4的cDNA序列為參考設計引物TP1和TP2，并分別與建庫時的5′ PCR primer引物和CDS III/3′ PCR primer的修飾引物TP3配對，擴增雙團棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4的cDNA的5′端和3′端，引物序列對如下：5′端cDNA擴增引物對：5′ PCR primer：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，反向引物TP1：5′-TTCATGCACGGTCTTTCATGCCACC-3′；3′端cDNA擴增引物對：正向引物TP2：5′-GGCCTTCTAAAGAAACAATTGAACAAG-3′，反向引物TP3：5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3′。TRIzol提取皮膚總RNA后，cDNA文庫構建試劑盒擴增總cDNA，以100倍稀釋的總cDNA為模板擴增目標片段。PCR反應程序為： ①95℃，4 min；②35個循環：94℃，30 s；56℃，30 min；72℃，55 s；③72℃，10 min。取5 μL PCR產物作1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用膠回收試劑盒回收PCR產物克隆到載體后測序。

1.2.2序列分析及系統進化樹的構建根據相似性拼接測序結果，并在NCBI非冗余序列數據庫(nr)中進行同源性搜索；用Clustal W 1.83軟件進行同源性分析及多重序列比較；用Mega 3.0軟件進行系統發育分析；用鄰接法構建系統進化樹，自展檢驗估計NJ法所構建系統樹的可靠性，重復次數為1 000。

1.2.3促血管生成活性的檢測雙團棘胸蛙胸腺肽pTβ4-1和pTβ4-2由本實驗室采用Fmoc法合成；雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增殖、小管形成實驗依據我們以前報道的方法進行[7]。內皮細胞小管生成和增殖率計算公式: 增長百分率/%=(試驗組平均值-生理鹽水對照組平均值)/生理鹽水對照組平均值×100%。

2結果

2.1雙團棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4的擴增結果如Fig 1所示，我們利用四對引物擴增到了兩個片段，他們的大小在500 bp左右，與棕點湍蛙相應片段的大小很相似。

Fig 1　PCR of the genes of thymosin-β4 from Nanorana yunnanensis skins

1: The PCR product of antisense TP1 and 5′ PCR primer; 2: DL 1 500 marker; 3: The product of sense TP2 and TP3 primer.

2.2cDNA序列和推導氨基酸序列根據測序結果進行拼接，我們得到pTβ4-1和pTβ4-2的cDNA序列。它們的cDNA序列及推導氨基酸序列如Fig 2所示。pTβ4-1和pTβ4-2的cDNA和蛋白序列間的相似性分別為90.3%和93.2%。含44個氨基酸的成熟蛋白的編碼區都有2個連在一起的終止密碼；3′-端的非翻譯區都包含一個26 bp或28 bp堿基的Ploy(A)尾巴和一個加尾識別信號(AATAAA)；pTβ4-1及pTβ4-2的推導蛋白包含有胸腺肽β4保守的兩端α-螺旋區和中間的G-肌動蛋白結合區。與其他動物來源的胸腺肽-β4氨基酸序列比較(Fig 3)，他們的變異發生在16位點和40位后的氨基酸，因此pTβ4-1及pTβ4-2的核酸和蛋白序列都具有胸腺肽-β4的典型結構特征[2-3,6]。此外，從Fig 4來看，pTβ4-1和pTβ4-2在進化樹上和棕點湍蛙的最近，和魚類最遠。

Fig 2　Nucleotide and deduced amino acid sequences of

The nucleotide sequences are from 5 to 3 terminal and the responding amino acid sequences are shown below. * is stop code at 3′ terminal and _ is stop code at 5′ terminal.__are polyA recongination signal. A:The sequence of pTβ4-1; B:The sequence of pTβ4-2.

Fig 3　Multiple amino acid sequence alignment between the

The common amino acids are marked with ﹡. The pTβ4-1 and pTβ4-2 are deduced amino acid sequences of thymosin-β4fromNanoranayunnanensisskin and other thymosins-β4genes are from GenBank.

Fig 4Phylogenetic tree of thymosin-β4amino acid sequences from 8 species

Scientific name of 8 species and GenBank accession referred to Fig 4；Numbers at node are bootstrap values (1 000 replicates).

Fig 5Pro-angiogenic effect of thymosin-β4from

Nanoranayunnanensisin CAM

A: Control; B: 20 μg rh-bFGF; C: 5 μg pTβ4-1; D: 5 μg pTβ4-2

2.3雙團棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4的促血管生成作用雞胚絨毛尿囊膜血管生成實驗結果如Fig 5所示，生理鹽水對照和藥物處理組的CAM血管均生長良好，顏色鮮紅，血管分支適中，網絡清晰；但是 rh-bFGF、pTβ4-1和pTβ4-2處理組比生理鹽水對照組的周邊血管生長更旺盛，密度明顯增大，管徑粗且分支多。HUVEC增殖和血管形成結果如Fig 6A所示，細胞被處理16 h后，生理鹽水對照組與藥物處理組均有血管環形成，內皮細胞聚集發生。但是，接種雙團棘胸蛙皮膚胸腺肽pTβ4-1及pTβ4-2到HUVECs細胞16 h后明顯增加了內皮細胞網的面積、網管長度、網管數目和支點數目，它的效果和50 mg·L-1rh-bFGF相接近。根據統計學分析，相對于生理鹽水對照組，50 mg·L-1rh-bFGF、20 mg·L-1pTβ4-1和20 mg·L-1pTβ4-2處理組的血管內皮細胞增殖增長率為(22.2±4.1)%、(26.3±3.4)%、(24.1±4.2)%，而小管形成增長率為(18.2±3.1)%、(22.4±2.0)%、(28.1±4.2)%(Fig 6B)。因此，rh-bFGF、Tβ4-1和Tβ4-2均能促進內皮細胞小管形成和增殖，以及雞胚絨毛尿囊膜血管生長。

3討論

Fig 6Effects of thymosin-β4fromNanoranayunnanensison

proliferation and tube formation of HUVECs

A: Classic figures of proliferation and tube formation of HUVECs treated by normal saline (a), 50 mg·L-1rh-bFGF (b), 20 mg·L-1pTβ4-1 (c) and 20 mg·L-1pTβ4-2 (d); B: Statistical analysis of proliferation and tube formation of HUVEC treated by 50 mg·L-1rh-bFGF, 20 mg·L-1pTβ4-1 and pTβ4-2.**P<0.01vscontrol group

胸腺肽-β4是廣泛存在的蛋白家族。它有數個活性位點，N末端的SDKP通常抑制炎癥和降低纖維化，另外一個活性位點是包含了SDKP的N末端15個氨基酸，它能促進細胞生存和抑制凋亡，第三個活性位點LKKTETQ是激動蛋白結合域，其與血管生成、傷口治療、細胞遷移、肥大細胞脫顆粒等密切相關。這些活性位點的序列在所有胸腺肽-β4內幾乎100%相似[2-3]。本研究首次報道了來源于雙團棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4的序列和促血管生成作用。他們與來源于人類、家鼠、家雞、爪蟾、斑馬魚、大比目魚和棕點湍蛙的胸腺肽-β4氨基酸序列有77%~93%的相似性。雙團棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4的一級結構與已報道四足動物和人的胸腺肽-β4在兩端的α-螺旋區(4~15、30~40位點)及G-肌動蛋白結合區(17~25位點)氨基酸序列完全相同，氨基酸殘基有變化的位點為16位點及C-末端的40以后的幾個位點。這些特點符合胸腺肽-β4的典型特征，也能解釋其促血管活性。

人類及家鼠研究表明，胸腺肽-β4屬于多基因家族[8-9]。在同一組織或細胞，尤其在處于發育及分化不同階段的組織或細胞中有多個不同胸腺肽-β4mRNA表達以滿足發育及分化的時空性需求。因此，這些胸腺肽-β4在同一組織或細胞中可能有不同的功能[8-9]。我們利用保守序列克隆得到Tβ4-1和Tβ4-2的cDNA。Tβ4-1和Tβ4-2有三個氨基酸的差異，但有完全相同的功能區氨基酸和類似的促進血管生長作用。這種多樣性的存在可能與他們分別有其他功能或者兩個蛋白出現的時空差異有關。

在人類及其他哺乳動物皮膚僅有少量的胸腺肽-β4，兩棲動物中只在非洲爪蟾的卵和棕點湍蛙皮膚證實有mRNA的表達，但其功能卻有待明確。胸腺肽-β4有多種多樣的功能和作用，如促進血管生成、加速傷口愈合、促進毛發再生及抗微生物等[2-3]。鑒于兩棲類動物皮膚分泌物豐富，該類動物易于養殖，我們對雙團棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4的研究結果將促進該類動物的資源利用。最新研究表明，胸腺肽-β4可以在大腸桿菌里實現高純度表達。此外，合成的胸腺肽-β4也具有很高的活性[10-11]。這將意味著雙團棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4可能成為高價值和前景的藥物，繼而在臨床上推廣使用。

參考文獻:

[1]Goldstein A L, Guha A, Zatz M M, et al. Purification and biological activity of thymosin, a hormone of the thymus gland[J].ProcNatlAcadSciUSA, 1972, 69(7): 1800-3.

[2]Sosne G, Qiu P, Goldstein A L, et al. Biological activities of thymosin beta4 defined by active sites in short peptide sequences[J].FASEBJ, 2010, 24(7):2144-51.

[3]Philp D, Goldstein A L, Kleinman H K. Thymosin beta4 promotes angiogenesis, wound healing, and hair follicle development[J].MechAgeingDev, 2004, 125(2):113-5.

[4]Crockford D. Development of thymosin beta4 for treatment of patients with ischemic heart disease[J].AnnNYAcadSci, 2007, 1112(3): 385-95.

[5]梁建國.棕點湍蛙皮膚分泌液中活性肽分離純化、分子克隆以及結構與功能的研究[D].南京：南京農業大學,2006.

[5]Liang J G. Research on the structure and function relation, purification and molecular cloning of bioactive peptides from Amolops loloensis skin secretions [D]. Nanjing: Nanjing Agricultral Univerisity, 2006.

[6]Yamamoto M, Shoda A, Minamino N, et al. Expression of thymosin beta 4 gene during Xenopus laevis embryogenesis[J].BiochemBiophysResCommun, 1992, 184(1): 93-9.

[7]劉文君，徐學清.大胡蜂肥大細胞脫粒肽對血管生成的抑制作用[J].中國藥理學通報, 2014， 30(5)：715-8.

[7]Liu W J, Xu X Q. Inhibitory effect of mastoparan-like peptide from wasp (Vespa magnifica) venom on angiogenesis[J].ChinPharmacolBull, 2014, 30(5): 715-8.

[8]Clauss I M, Wathelet M G, Szpirer J, et al. Human thymosin-beta 4/6-26 gene is part of a multigene family composed of seven members located on seven different chromosomes[J].Genomics, 1991, 9(1): 174-80.

[9]Varghese S, Kronenberg H M. Rat thymosin beta 4 gene. Intron-containing gene and multiple retroposons[J].JBiolChem, 1991, 266(22): 14256-61.

[10]Li T, Ma S Y, Tang X C, et al. Production and characterization of highly purified recombinant thymosin beta 4 in Escherichia coli[J].ProteinExprPurif, 2013, 90(2): 90-5.

[11]Dettin M, Ghezzo F, Conconi M T, et al.Invitroandinvivopro-angiogenic effects of thymosin-b4-derived peptides[J].CellImmunol, 2011, 271(2): 299-307.

網絡出版時間：2015-1-9 13:37網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.018.html

Gene cloning and bioactive analysis of thymosin-β4from

skin ofNanoranayunnanensis

XU Xue-qing LIU Wen-jun

(SchoolofPharmaceuticalSciences,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Abstract:AimTo investigate the gene sequences and pro-angiogenic activities of thymosin-β4from skin of Nanorana yunnanensis. MethodsTwo cDNA sequences of thymosin-β4from Nanorana yunnanensis designated as pTβ4-1 and pTβ4-2 were obtained by PCR. The tube formation and proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and chicken chorioallantoic membrane (CAM) model were used to observe the pro-angiogenic effects of synthetic peptides according to the reduced amino acid sequences of pTβ4-1 and pTβ4-2 in vitro and in vivo, respectively. ResultsThe cDNA sequences of Tβ4-1 and pTβ4-2 were composed of 662 bp and 673 bp, respectively, and their deduced amino acid sequences contained 44 residues which shared highly similarity with those from human, mouse, chicken, claw frog, zebra fish, turbot and Amolops loloensis. Furthermore, the mature amino acid sequences of pTβ4-1 and pTβ4-2 had highly con served structural regions when compared with other thymosin-β4previously reported. Synthetic peptides could significantly promote proliferation and tube formation of HUVEC and angiogenesis of CAM. ConclusionThere are two thymosin-β4peptides in skins of Nanorana yunnanensis which have pro-angiogenic activities.

Key words:Nanorana yunnanensis; thymosin-β4; skin; cDNA sequences; amphibians; chicken chorioallantoic membrane; human umbilical vein endothelial cells

通訊作者

作者簡介:徐學清(1978-)，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：微生物與生化藥學，,E-mail: xu2003@smu.edu.cn

基金項目:國家自然科學基金資助項目(No 31370782)；廣東省優秀青年教師培養計劃資助項目

收稿日期:2014-11-17,修回日期:2014-12-13

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2015)02-0237-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.018