血管緊張素Ⅱ對足細胞Notch通路及Nephrin表達的影響

高　峰，張　濤，王曉梅，趙玉峰，劉淑霞

(1. 河北醫科大學第三醫院病理科，2. 河北醫科大學第三醫院腎內科，河北 石家莊　050051；3. 河北醫科大學病理教研室，河北 石家莊　050017)

血管緊張素Ⅱ對足細胞Notch通路及Nephrin表達的影響

高峰1，張濤2，王曉梅1，趙玉峰1，劉淑霞3

(1. 河北醫科大學第三醫院病理科，2. 河北醫科大學第三醫院腎內科，河北 石家莊050051；3. 河北醫科大學病理教研室，河北 石家莊050017)

中國圖書分類號：R-332；R322.61；R329.24；R692；R977.6

摘要：目的探討血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)刺激小鼠足細胞對Notch通路、Nephrin表達的影響。方法AngⅡ 刺激小鼠足細胞并給予纈沙坦干預，采用免疫熒光化學、Western blot、Real-time PCR方法檢測Notch1、Notch胞內域1(NICD1)、Hes1、Nephrin的表達情況。結果AngⅡ呈時間依賴性增加足細胞Notch1、NICD1、Hes1表達，抑制Nephrin表達(P<0.01)；纈沙坦可抑制AngⅡ對Notch通路的活化，增加Nephrin的表達(P<0.01)。結論AngⅡ 通過激活Notch通路降低足細胞Nephrin表達。

關鍵詞：血管緊張素Ⅱ；足細胞；Notch通路；Nephrin；血管緊張素Ⅱ 1受體阻斷劑；纈沙坦

已發現腎素-血管緊張素系統(renin angioten sin system, RAS)在多種腎臟疾病腎組織中被激活[1]。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)作為RAS系統的主要效應因子，在腎組織內常明顯升高，可以通過多種途徑造成足細胞損傷，導致腎小球硬化，加速腎臟疾病的進展[2-3]。近年來發現，Notch通路在多種腎臟疾病足細胞中被激活，Notch受體釋放出其活化形式NICD進入細胞核內，調控其下游基因Hes，參與腎小球足細胞損傷[4]。Nephrin是重要的足細胞特異蛋白，表達在裂孔隔膜上，其表達量的改變與足細胞損傷程度密切相關。已有研究發現在糖尿病小鼠模型和高糖培養的足細胞中，Notch通路對Nephrin表達起調控作用，但AngⅡ對足細胞Notch通路活化及Nephrin表達的影響還不清楚[5]。本研究通過體外AngⅡ刺激小鼠足細胞，觀察其對Notch1、NICD1、Hes1和Nephrin表達的影響，并給予血管緊張素Ⅱ 1受體阻斷劑(angiotensin Ⅱ type 1 receptor antagonism, AT1Ra)纈沙坦干預，以證實AngⅡ對Notch信號通路活化及Nephrin表達的影響。

1材料與方法

1.1材料條件永生性小鼠足細胞購自北京協和細胞中心。小鼠γ-干擾素購自Peprotech公司。RPMI 1640培養基為Gibco公司產品。AngⅡ購自Sigma公司。兔抗β-actin多克隆抗體購自Santa Cruz公司。兔抗NICD1、Hes1和Hey1多克隆抗體購自Abcam公司。Real-time PCR試劑盒購自TaKaRa公司。纈沙坦為北京諾華公司產品。

1.2細胞培養及分組小鼠足細胞在33℃ CO2培養箱中，以含有10%胎牛血清及10 000 U·L-1γ-干擾素的RPMI 1640培養液培養細胞使其增殖，傳代后更換不含γ-干擾素的RPMI 1640培養液，在37℃ CO2培養箱中培養10~14 d促進分化。同步化24 h后，AngⅡ(10-6mol·L-1)刺激0、12、24、48、72 h后收集細胞進行相關指標檢測。隨后在AngⅡ刺激的同時加入纈沙坦(10-6mol·L-1)給予干預。

1.3免疫熒光化學檢測Nephrin蛋白表達細胞于75%乙醇室溫固定30 min，0.3% Triton X-100 37℃打孔15 min。加入正常山羊血清，37℃、30 min封閉內源性生物素，棄血清，加入Nephrin多克隆抗體，4℃過夜。滴加FITC標記的熒光二抗，37℃避光孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察結果。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.4Western blot檢測Notch1、NICD1、Hes1、Nephrin蛋白表達用RIPA裂解液(含1×PBS、1%NP-40、0.5%去氧膽酸鈉、0.1% SDS，用前加PMSF 0.1 g·L-1)提取細胞總蛋白，取30 μg樣品SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入Notch1、NICD1、Hes1、Nephrin、β-actin多克隆抗體4℃孵育過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標記IgG二抗，37℃孵育2 h，暗室中顯影，底片經掃描儀透掃后凝膠分析軟件分析結果。與β-actin光密度的比值分別表示其相對表達量。

1.5Real-time PCR檢測Notch1、Hes1、Nephrin mRNA表達TRIzol 提取細胞總RNA。反轉錄反應體系總體積為20 μL，按照反轉錄說明書合成cDNA。引物分別為：18S，上游5′-CGCCGCTAGAGGTGAAATTC-3′，下游5′-CCAGTCGGCATCGTTTATGG-3′；Notch1，上游5′-GTGGATGACCTAGGCAAGTCG-3′，下游5′-GTCTCCTCCTTGTTGTTCTGCA-3′；Hes1，上游5′-CACGACACCGGACAAACCA-3′，下游5′-GCCGGGAGCTATCTTTCTTAAGTG-3′；Nephrin，上游5′-TACCACCAGCATTTCCACG-3′，下游5′-GGGCTCGGCTGTATGTATT-3′，均由北京奧科公司合成。PCR反應體系總體積為50 μL，擴增條件為94℃預變性2 min，94℃變性25 s，60℃退火30 s，40個循環結束。由PCR反應曲線得到Ct值，采用2-△△Ct法計算相對定量結果。

2結果

2.1AngⅡ對足細胞Notch通路及Nephrin表達的影響Western blot檢測顯示：AngⅡ呈時間依賴性刺激Notch1、NICD1、Hes1蛋白表達增加(P<0.01)，其中Notch1蛋白在AngⅡ刺激12 h開始增加，24 h達到最高點，48 h和72 h相對24 h稍有下降(P<0.05)，但仍高于AngⅡ刺激0 h；NICD1和Hes1蛋白表達最高點都在12 h，24、48、72 h相對24 h表達下降(P<0.05或P<0.01)，NICD1蛋白在AngⅡ刺激72 h表達仍高于0 h(P<0.01)，Hes1蛋白在AngⅡ刺激72 h與0 h表達無明顯差異(P>0.05)；AngⅡ呈時間依賴性抑制Nephrin蛋白表達，表達最低點在AngⅡ刺激72 h(P<0.01)(Fig 1)。Real-time PCR檢測顯示：Notch1 mRNA在AngⅡ刺激12 h增加，24 h表達最強(P<0.01)，72 h相對24 h表達有所下降(P<0.05)，但仍高于0 h(P<0.01)；Hes1 mRNA在AngⅡ刺激12 h表達最強(P<**P<0.01vsAngⅡ 0 h;△P<0.05vsAngⅡ 24 h;#P<0.05,##P<0.01vsAngⅡ 12 h

<0.01)，隨著刺激時間的延長表達降低(P<0.01)，在AngⅡ刺激72 h與0 h表達無明顯差異(P>0.05)；AngⅡ呈時間依賴性抑制Nephrin mRNA表達，表達最低點在AngⅡ刺激72 h(P<0.01)(Fig 2)。

Fig 1　Expression of Notch1, NICD1, Hes1 and Nephrin protein

Fig 2Expression of Notch1, Hes1 and Nephrin mRNA

in AngⅡ-stimulated podocyte by Real-time PCR

**P<0.01vsAngⅡ 0 h;△P<0.05vsAngⅡ 24 h;##P<0.01vsAngⅡ 12 h

2.2纈沙坦對AngⅡ刺激足細胞Notch通路及Nephrin表達的影響免疫熒光化學顯示，Nephrin在足細胞胞質表達，AngⅡ刺激12 h時表達較0 h時減少，纈沙坦可增加Nephrin在AngⅡ刺激后的表達(Fig 3)。與AngⅡ刺激0 h相比，AngⅡ刺激12 h時Notch1、NICD1、Hes1蛋白及Notch1、Hes1 mRNA表達增加(P<0.01)，纈沙坦可減少AngⅡ刺激12 h時Notch1、NICD1、Hes1蛋白及Notch1、Hes1 mRNA表達(P<0.01)；與AngⅡ刺激0 h相比，AngⅡ刺激12 h時Nephrin蛋白及mRNA表達降低，纈沙坦可增加AngⅡ刺激12 h時Nephrin蛋白及mRNA表達(P<0.01)(Fig 4、5)。

Fig 3Effect of valsartan on expression of Nephrin protein in AngⅡ-stimulated podocyte by immunofluorescence

A:0 h; B:12 h; C:12 h+valsartan

Fig 4Effect of valsartan on expression of Notch1, NICD1, Hes1 and Nephrin protein in AngⅡ-stimulated podocyte by Western blot

**P<0.01vsAngⅡ 0 h;##P<0.01vsAngⅡ 12 h

Fig 5　Effect of valsartan on expression of Notch1, Hes1 and

**P<0.01vsAngⅡ 0 h;##P<0.01vsAngⅡ 12 h

3討論

AngⅡ在多種腎臟疾病腎組織內常明顯升高，通過血流動力學及非血流動力學因素，對足細胞產生損傷，引起足細胞固有蛋白表達減少，破壞濾過膜，導致發生蛋白尿、腎小球硬化、最終引起腎功能衰竭[2]。本實驗發現，AngⅡ刺激小鼠足細胞后，可使Notch通路受體Notch1、活化形式NICD1及其下游基因Hes1表達增加，表達強度最強時間點在24 h和12 h，隨后，隨著AngⅡ刺激時間的延長表達降低，說明AngⅡ可以在較短的時間內就激活足細胞Notch信號通路。AngⅡ刺激足細胞Notch1受體表達增加并向細胞內釋放出NICD1，NICD1進入細胞核內調控Hes1表達，進而參與足細胞損傷過程。Ozasa 等[6]用AngⅡ刺激血管平滑肌細胞后，發現AngⅡ通過激活Notch通路促進細胞增殖和遷移。You等[7]發現阻斷AngⅡ作用后，可通過抑制Notch通路活化，減輕因持續血壓負荷引起的心室肥大、功能失常。

Nephrin是重要的裂孔膜蛋白，當足細胞受到損傷時，Nephrin表達降低造成裂孔膜結構破壞，功能喪失，影響腎小球濾過功能，產生大量蛋白尿[8]。AngⅡ刺激足細胞后，發現Nephrin表達明顯降低，說明AngⅡ可通過降低足細胞特異蛋白，引起足細胞損傷。纈沙坦是當今臨床上常用的治療腎臟疾病的AT1Ra類藥物，研究發現其對腎臟的保護作用，不僅僅取決于降低血壓的作用[9]。本研究發現，在AngⅡ刺激的小鼠足細胞中給予纈沙坦后，抑制Notch通路的活化，進而增加足細胞Nephrin蛋白及mRNA的表達，說明AngⅡ在足細胞可能通過Notch通路調控Nephrin表達，纈沙坦能抑制Notch通路，減少足細胞損傷過程，從而達到對腎臟疾病的治療作用。

總之，AngⅡ可激活足細胞Notch通路，抑制Nephrin表達。纈沙坦能抑制AngⅡ對Notch通路的活化，增加Nephrin表達，達到治療腎臟疾病的作用。

參考文獻:

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網絡出版時間：2015-1-9 13:37網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.020.html

Effect of angiotensin Ⅱ on expression of Notch pathway and Nephrin in podocyte

GAO Feng1, ZHANG Tao2, WANG Xiao-mei1, ZHAO Yu-feng1, LIU Shu-xia3

(1.DeptofPathology, 2.DeptofNephrology,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China;

3.DeptofPathology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Abstract:AimTo investigate the expression of Notch pathway and Nephrin in angiotensin Ⅱ (AngⅡ)-stimulated mice podocyte. MethodsMice podocyte was stimulated by AngⅡ, and then was treated with valsartan. The levels of Notch1, Notch intracellular domain 1 (NICD1), Hes1 and Nephrin were determined by immunofluorescence, Western blot and Real-time PCR. ResultsAngⅡ increased Notch1, NICD1 and Hes1 expression, and decreased Nephrin expression in a time-dependent manner (P<0.01). Valsartan inhibited AngⅡ-induced activation of Notch pathway and enhanced Nephrin level (P<0.01). ConclusionAngⅡ decreases Nephrin expression in podocyte by activating Notch pathway.

Key words:angiotensin Ⅱ; podocyte; Notch pathway; Nephrin; angiotensin Ⅱ type 1 receptor antagonism; valsartan

通訊作者劉淑霞(1975-)，女，博士，教授，研究方向：腎臟疾病發病機制，，E-mail：susanliu1976@163.com

作者簡介：高峰(1978-)，男，博士，副主任醫師，研究方向：腎臟疾病發病機制，E-mail：alan846829@163.com;

基金項目：河北省自然科學基金資助項目(No H2014206294)；河北省醫學科學研究重點課題(No ZL20140030)

收稿日期:2014-11-22,修回日期:2014-12-27

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2015)02-0247-04

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.020