夏枯草總三萜調控ERK、TGF-β1/Smad通路對肝纖維化大鼠的保護作用研究

章圣朋，何　勇，徐　濤，黃　成，謝加力，鄧子煜，李　俊

(1.安徽醫科大學藥學院，安徽 合肥　230032；2.皖南醫學院藥學院，安徽 蕪湖　241002；3.安徽省創新藥物產業共性研究院，安徽 合肥　230032； 4.蕪湖市第二人民醫院藥劑科,安徽 蕪湖　241001；5.安徽醫科大學第二附屬醫院藥劑科，安徽 合肥　230601)

夏枯草總三萜調控ERK、TGF-β1/Smad通路對肝纖維化大鼠的保護作用研究

章圣朋1,2，何勇1,3，徐濤1,3，黃成1,3，謝加力4，鄧子煜5，李俊1,3

(1.安徽醫科大學藥學院，安徽 合肥230032；2.皖南醫學院藥學院，安徽 蕪湖241002；3.安徽省創新藥物產業共性研究院，安徽 合肥230032； 4.蕪湖市第二人民醫院藥劑科,安徽 蕪湖241001；5.安徽醫科大學第二附屬醫院藥劑科，安徽 合肥230601)

中國圖書分類號：R-332；R284.1；R322.47；R329.24；R575.2

摘要：目的研究夏枯草總三萜(TTP)對四氯化碳(CCl4)致肝纖維化大鼠的保護作用及其分子機制。方法SD大鼠隨機分為正常組、模型組、TTP(25、50、100 mg·kg-1)組和陽性對照組(秋水仙堿0.1 mg·kg-1)，除正常組外，其余各組分別于大鼠背部皮下注射CCl40.1 ml·(100 g)-1，每周2次，連續12周，自造模第5周起開始給藥，各給藥組分別給予相應的藥物，正常組、模型組給予等體積的溶媒，每天1次。實驗結束后，比色法測定血清中丙氨酸氨基轉氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)含量；放免法測定透明質酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)含量；同時取固定部位肝組織，蘇木精伊紅染色(HE)、Masson染色觀察肝纖維化程度；制備100 g·L-1肝勻漿，進行丙二醛(MDA)、超(過)氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、羥脯氨酸(Hyp)含量測定；RT-PCR法檢測α-SMA、Procollagen I、Smad2、Smad3 和 Smad7 mRNA表達；Western blot法檢測p-ERK蛋白表達。結果與模型組相比，TTP(25、50、100 mg·kg-1)給藥組不僅能降低肝纖維化大鼠ALT、AST、HA、CⅣ、PCⅢ、Hyp水平，改善肝臟病變程度，降低MDA水平，增強SOD以及GSH-Px活性，還可抑制肝組織中α-SMA、Procollagen I、Smad2、Smad3及p-ERK表達，升高Smad7表達。結論夏枯草總三萜對CCl4誘導的肝纖維化大鼠具有較好的保護作用，其機制可能與下調p-ERK表達，調控TGF-β1/Smad信號通路有關。

關鍵詞：夏枯草總三萜；肝纖維化；四氯化碳；脂質過氧化；TGF-β1/Smad信號通路；大鼠

肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是肝臟對慢性損傷的修復反應，肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)激活是HF的中心環節，活化的HSC增生擴散，分泌細胞外基質(extracellular matrix, ECM)等多種物質，使ECM合成與降解失衡，在肝臟過度沉積，肝臟結構改變，導致肝纖維化[1]。夏枯草為一味傳統中藥，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤功效[2]，現代臨床多用于治療急性傳染性肝炎等疾病。文獻報道[3]，夏枯草水提取物可抑制人肝癌細胞金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9活性。 MMP-2和MMP-9均可促進HSC增殖，上調肝臟TGF-β1表達，因此，夏枯草水提取物具有治療HF的潛在作用。三萜類物質是夏枯草主要成分，與其藥理作用明顯相關[4]。前期研究顯示[5]，夏枯草總三萜(total triterpenoid of Prunella vulgaris L.,TTP)對CCl4誘導的大鼠急性肝損傷模型具有保護作用。本實驗在前期研究基礎上，研究TTP對CCl4誘導肝纖維化大鼠的防治作用，觀察TTP對肝纖維化膠原Procollagen Ⅰ分泌、HSC活化標志α-SMA的影響，并探討TTP對p-ERK以及TGF-β1/Smad信號通路的影響，為防治肝纖維化提供實驗和理論依據。

1材料

1.1藥品與試劑夏枯草總三萜，購自西安小草科技股份有限公司，含量>75%； 秋水仙堿購于西雙版納藥業有限公司，以5g·L-1羧甲基纖維素鈉溶液配成相應濃度的混懸液使用。CCl4，購于汕頭西隴化工廠，臨用前用魯花花生油1 ∶1稀釋 。ALT、AST、SOD、MDA、GSH-Px、Hyp試劑盒購于南京建成生物工程研究所。HA、CⅣ、PCⅢ放射免疫試劑盒購于北京北方生物技術研究所。TRIzol Reagent試劑購自Invitrogen Life Technologies公司。逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒購自Fermentas公司。α-SMA、Procollagen Ⅰ、Smad2、Smad3、Smad7、β-actin引物序列由上海生工工程技術服務有限公司合成。大鼠p-ERK抗體購于美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標記二抗購于北京中杉公司；ECL發光試劑盒購于Pierce公司。

1.2實驗動物♂ SD大鼠，體質量180~220 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。大鼠飼養于透氣籠中，每組10只，自由攝食飲水，溫度18℃~22℃，正常光照。

2方法

2.1動物分組與處理大鼠適應性飼養1周后，隨機分為正常組、模型組、TTP給藥組(25、50、100 mg·kg-1)、陽性對照組(秋水仙堿0.1 mg·kg-1)，每組10只。除正常組外，其余各組分別于大鼠背部皮下注射CCl40.1 ml·(100 g)-1，每周2次，連續12周。自造模第五周起開始給藥，各給藥組分別給予相應的藥物，正常組、模型組給予等體積的溶媒，每天1次，至實驗結束，每周稱重1次，調整用藥劑量。末次給藥后，禁食8h處死動物，制備血清，取肝臟組織，檢測相關指標。

2.2血清學指標檢測大鼠血樣4℃、3 500 r·min-1離心15 min，取血清。檢測血清中AST、ALT、HA、CⅣ、PCⅢ含量。

2.3病理學指標檢測肝組織脫水，石蠟包埋處理，HE、Masson染色切片，光鏡下觀察纖維化的有無及程度。

2.4組織學指標檢測取適量肝右葉組織，用冷生理鹽水制成100 g·L-1肝勻漿，4℃、3 500 r·min-1離心15 min，取上清，進行MDA、SOD、GSH-Px 、Hyp含量測定。

2.5RT-PCR分析α-SMA、Procollagen Ⅰ、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA水平取100 mg肝組織，按TRIzol試劑盒說明書提取肝組織總RNA，按RT-PCR試劑盒說明書，逆轉錄合成cDNA。各引物序列、產物大小及反應條件見Tab 1。擴增產物進行凝膠電泳，拍照，以β-actin為內參，凝膠成像系統進行密度掃描，以目的基因與β-actin光密度比值表示目的基因的相對量。

Tab 1　Primers

2.6Western blot 檢測肝組織中p-ERK蛋白水平取100 mg肝組織，加入1 mL RIPA 組織裂解液(每mL裂解液中加10 μL PMSF)，冰上進行組織勻漿，12 000 r·min-1離心10 min，取上清。加上樣緩沖液，100℃加熱10 min使蛋白變性。每孔加入8 μL總蛋白，進行SDS-PAGE電泳。結束后，半干轉將蛋白轉移到PVDF膜上，電壓15V，時間30 min。膜在室溫下用50 g·L-1脫脂奶粉封閉，漂洗后加入一抗，4℃過夜孵育。再加入相匹配的二抗，放置1 h。ECL試劑盒顯影，以ERK為內參，分析條帶吸光度值。

3結果

3.1TTP對CCl4誘導的肝纖維化大鼠血清中AST、ALT、HA、CⅣ、PCⅢ含量的影響結果如Tab 2所示，與正常組相比，模型組血清ALT、AST水平明顯升高(P<0.01)，TTP各劑量組可降低模型大鼠血清ALT、AST水平(P<0.05，P<0.01)；模型組大鼠血清纖維化指標HA、CⅣ、PCⅢ與正常組相比明顯增加(P<0.01)，TTP各劑量組明顯降低模型大鼠血清HA、CⅣ、PCⅢ含量(P<0.05，P<0.01)，提示TTP具有肝臟保護作用。

Tab 2　Effect of TTP on serum ALT, AST, HA, CⅣ, PCⅢ±s,n=10)

**P<0.01vsnormal;#P<0.05，##P<0.01vsmodel

3.2TTP對CCl4誘導的肝纖維化大鼠肝臟病理形態學影響HE染色顯示，正常組大鼠肝細胞完整，肝組織無異常纖維增生；模型組可見肝小葉結構破壞，成纖維細胞出現，假小葉形成，肝組織中有明顯炎性細胞浸潤；TTP低、中、高劑量組和秋水仙堿組可見匯管區纖維結締組織增生減少，有少量炎性細胞浸潤，未見假小葉形成，肝纖維化呈現好轉的趨勢(Fig 1)。Masson染色結果顯示，正常大鼠肝細胞完整，無纖維組織增生。模型組大鼠有較多的成纖維細胞出現，纖維結締組織增生，肝索排列紊亂并伴有假小葉形成。TTP治療組肝纖維化均有不同程度的改善，結締組織增生減少，炎性浸潤程度減輕，其中以TTP 100 mg·kg-1最為明顯，脂肪變性基本消失，肝組織結構趨向正常(Fig 2)。

Fig 1Photomicrographs of liver sections stained

with HE′s trichrome(×200)

A:Normal; B:Model; C:TTP (25 mg·kg-1); D: TTP (50 mg·kg-1); E: TTP (100 mg·kg-1); F: Colchicine (0.1 mg·kg-1)

Fig 2Photomicrographs of liver sections stained

with Masson′s trichrome(×100)

A:Normal; B:Model; C:TTP (25 mg·kg-1); D: TTP (50 mg·kg-1); E: TTP (100 mg·kg-1); F: Colchicine (0.1 mg·kg-1)

所示，相比正常組，模型組大鼠肝組織MDA和Hyp水平明顯上升(P<0.01)，SOD和GSH-Px水平明顯下降(P<0.01)；與模型組相比，TTP和秋水仙堿組能明顯降低MDA和Hyp水平(P<0.05，P<0.01)，增加SOD含量，上調GSH-Px表達水平(P<0.05，P<0.01)。

3.4TTP對CCl4誘導的肝纖維化大鼠肝臟α-SMA、Procollagen Ⅰ、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達影響如Fig 3 所示，與正常組相比，模型組大鼠肝組織中α-SMA、Procollagen Ⅰ、Smad2、Smad3 mRNA表達均明顯升高(P<0.01)，Smad7 mRNA表達降低(P<0.01)；與模型組相比，TTP給藥組可降低α-SMA、Procollagen Ⅰ、Smad2、Smad3 mRNA表達(P<0.05，P<0.01)，升高Smad7 mRNA表達(P<0.05，P<0.01)。

GroupDose/mg·kg-1Hyp/μg·g-1SOD/kU·g-1ProMDA/μmol·g-1ProGSH-Px/kU·g-1ProNormal-114.75±17.87143.76±22.52.66±0.39188.35±26.47Model-404.26±58.50**87.55±14.30**4.73±0.68**76.97±13.72**TTP25358.12±41.9995.61±17.03#3.95±0.92#100.05±20.59#50259.37±36.17##107.11±16.05##3.55±0.79#130.11±21.63#100162.82±20.25##122.31±18.76##3.30±0.56#161.23±29.94#Colchicine0.1184.18±21.24##107.20±17.75##3.38±0.64##113.02±16.60##

**P<0.01vsnormal;#P<0.05，##P<0.01vsmodel

Fig 3　Effect of TTP on α-SMA, procollagen I, Smad2, Smad3

1:Normal; 2:Model; 3:TTP (25 mg·kg-1); 4: TTP (50 mg·kg-1); 5: TTP (100 mg·kg-1).**P<0.01vsnormal group;#P<0.05，##P<0.01vsmodel group

3.5TTP對CCl4誘導的肝纖維化大鼠肝臟p-ERK蛋白表達影響結果如Fig 4所示，模型組大鼠肝組織中p-ERK蛋白表達水平高，與正常組相比，差異具有顯著性(P<0.01)。與模型組相比較，TTP作用大鼠后，肝組織中p-ERK蛋白表達明顯降低(P<0.01)，并呈現劑量依賴性，表明TTP可以降低肝纖維化大鼠肝組織中p-ERK蛋白表達。

4討論

臨床實踐表明，HA、CⅣ、PCⅢ水平與肝組織炎癥和纖維化緊密相關[6-7]。HA主要在肝臟內清除，肝臟損傷時其分解HA的功能遭到破壞，因此HA是反映肝功能和肝纖維化的良好指標。CⅣ隨著肝臟炎癥程度增加，其表達也逐步升高[8]。PCⅢ與肝纖維化程度呈正相關。肝纖維化以ECM過度沉積為病理學特征，ECM主要成分為膠原纖維，由膠原蛋白構成，Hyp常被認為是膠原蛋白特有成分，因此，肝組織Hyp含量可間接反映肝纖維化程度[9]。聯合檢測以上指標，對于診斷肝纖維化具有重要價值。本研究發現，CCl4誘導的肝纖維化大鼠血清中ALT、AST、HA、CⅣ、PCⅢ以及肝組織中Hyp含量明顯升高，提示肝纖維化模型建立成功；TTP各劑量組可明顯降低肝纖維化大鼠ALT、AST、HA、CⅣ、PCⅢ、Hyp水平；病理學檢測顯示，TTP給藥組明顯減少肝組織中炎性細胞浸潤與膠原組織增生；RT-PCR結果發現，TTP可明顯降低Procollagen Ⅰ膠原的分泌。以上研究結果提示，TTP對于CCl4誘導的肝纖維化具有有效的保護作用。

Fig 4Effect of TTP on p-ERK protein expression

1:Normal; 2:Model; 3:TTP (25 mg·kg-1); 4: TTP (50 mg·kg-1); 5: TTP (100 mg·kg-1).**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsmodel group

氧自由基及其引起的脂質過氧化在肝纖維化發展過程中發揮著重要的作用，脂質過氧化產物可以直接激活HSC，介導HSC增殖、分化和膠原形成[10]。SOD是機體超氧自由基消除劑，常被作為抗氧化能力的敏感指標。MDA表達異常可導致炎癥和肝細胞損傷，其含量與機體內脂質過氧化程度相平行。GSH-Px可保護細胞膜結構和功能的完整性，清除體內過多的脂質過氧化物。進一步研究發現，TTP各劑量組可明顯降低MDA水平，增強SOD以及GSH-Px活性，這表明TTP具有減輕肝臟脂質過氧化損傷，調節脂質代謝，增強肝臟抗氧化能力作用。這可能是TTP作用機制之一。

HSC是肝臟分泌ECM的主要細胞，HSC激活是HF形成的中心環節。RT-PCR結果發現，肝纖維化大鼠HSC活化標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)與正常組比較明顯增高。細胞因子網絡調節對HSC活化起著重要的作用，轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)是其中重要的細胞因子。TGF-β1通過庫否細胞分泌產生，激活HSC，同時能促進HSC自分泌TGF-β1，激活臨近HSC大量合成Ⅰ型前膠原、Ⅲ型膠原[11]。研究證實，TGF-β1可通過TGF-β1/Smad和ERK信號傳導通路誘導HSC膠原生產。Smads蛋白家族是TGF-β1/Smad信號過程中最重要的胞內效應分子， Smad2、Smad3在HSC中被TGF-β1磷酸化，與 Smad4形成異源寡聚物，將TGF-β1信號從胞質向胞核轉位聚集；Smad7是TGF-β1/Smad信號通路的抑制因子，阻止Smad2、Smad3的磷酸化，從而對TGF-β1/Smad信號通路發揮負性調控[12-13]。HSC激活過程中，抑制ERK活性后能有效減少HSC自分泌TGF-β1，提示ERK信號通路參與調控HSC自分泌TGF-β1過程。本實驗研究發現，在CCl4誘導的肝纖維化模型大鼠肝組織中，Smad2、Smad3 mRNA以及p-ERK蛋白表達增高，Smad7 mRNA表達降低；而TTP對模型大鼠α-SMA、Procollagen Ⅰ、Smad2、Smad3、p-ERK有明顯的降低作用，對 Smad7 有升高作用。以上結果說明，TTP對肝纖維化的防治作用可能與下調p-ERK表達，抑制TGF-β1/Smad通路有關。

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網絡出版時間：2015-1-9 13:37網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.023.html

Regulatory effects of total triterpenoid of Prunella vulgarisL.on activities of

ERK and TGF-β1/Smad signaling pathway in protecting hepatic fibrosis in rats

ZHANG Sheng-peng1,2, HE Yong1,3, XU Tao1,3, HUANG Cheng1,3, XIE Jia-li4, DENG Zi-yu5, LI Jun1,3

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China; 2.SchoolofPharmacy,Wannan

MedicalCollege,WuhuAnhui241002,China; 3.AnhuiInstituteofInnovativeDrugs,Hefei230032,China;

4.DeptofPharmacy,WuhuNO.2People′sHospital,WuhuAnhui241001,China; 5.DeptofPharmacy,

theSecondAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230601,China)

Abstract:AimTo investigate the protective effects of total triterpenoid from Prunella vulgaris L.(TTP) on

CCl4-induced hepatic fibrosis in rats and its mechanism. MethodsRat liver fibrosis was induced by 50% CCl4twice a week for 12 weeks. From the 5th week, all the therapeutic groups were treated with the TTP(25, 50, 100 mg·kg-1) and the colchicine (0.1 mg·kg-1) respectively once a day for 8 weeks. At the end of the twelfth week, the levels of ALT, AST, HA, PCⅢ, CⅣ, MDA, SOD, GSH-Px, Hyp were measured. HE and Masson staining were used to evalulate the degree of hepatic fibrosis. The mRNA expression of α-SMA, procollagen I, Smad2, Smad3, Smad7 in liver was detected by RT-PCR, and the p-ERK protein expression was evaluated by Western blot. ResultsCompared with the model group, TTP(25, 50, 100 mg·kg-1) not only reduced serum content of ALT, AST, HA, PCⅢ, CⅣ and Hyp, MDA in liver tissue, improved the morphologic changes of hepatic fibrosis, but also increased SOD and GSH-Px activity. Moreover, it decreased the α-SMA, procollagen I, Smad2, Smad3 mRNA expression and increased Smad7 mRNA expression in liver tissues obviously. Furthermore, TTP reduced the protein expression of p-ERK. ConclusionsTTP can protect rats from CCl4-induced liver fibrosis. The mechanism of this process may involve inhibiting the expression of p-ERK and interference with TGF-β1/Smad signal transduction pathway.

Key words:total triterpenoid of Prunella vulgarisL.(TTP); liver fibrosis; CCl4; lipid peroxidation; TGF-β1/Smad signaling pathway; rat

通訊作者李俊(1960-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：肝臟藥理學、抗炎免疫藥理學，，Tel: 0551-65161001，E-mail: lijun@ahmu.edu.cn

作者簡介：章圣朋(1984-)，男，碩士，助教，研究方向：抗炎免疫藥理學，Tel：0553-3932185，E-mail：wnmczhang@sina.com；

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81273526)；安徽省科技廳項目(No KJ2012A156)

收稿日期:2014-10-24,修回日期:2014-11-20

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2015)02-0261-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.023