Tat-LK15運載siRNA沉默RGC-5神經細胞nNOS基因的實驗研究

彭　捷,饒　云,陸建華,吳昊澎,楊秀環,屠偉峰

(廣州軍區廣州總醫院麻醉科，廣東廣州　510010)

Tat-LK15運載siRNA沉默RGC-5神經細胞nNOS基因的實驗研究

彭捷,饒云,陸建華,吳昊澎,楊秀環,屠偉峰

(廣州軍區廣州總醫院麻醉科，廣東廣州510010)

中國圖書分類號：R329.25；R341.6；R342.2；R394.2；R441.1；R741.02

摘要：目的探討離體條件下細胞穿透肽Tat-LK15運載小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)沉默RGC-5視神經節細胞(retinal ganglion cell line, RGC-5)神經元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)基因的可行性，為在體條件下研究Tat-LK15運載siRNA沉默nNOS表達治療神經病理性疼痛提供理論依據。方法① 通過凝膠阻滯分析測定Tat-LK15與siRNA的最佳交聯比。流式細胞術檢測Tat-LK15/ FAM-siRNA以最佳交聯比轉染RGC-5細胞的轉染效率；不同劑量Tat-LK15(1、2.5、5、10和20 μg)孵育RGC-5細胞24 h，流式細胞術檢測細胞凋亡率。② 制備nNOS高表達的RGC-5細胞模型。③ 將RGC-5細胞隨機分為5組：對照組、模型組、Tat-S組(Tat-LK15運載nNOS/siRNA轉染模型細胞)、Lipo-S組(LipofectamineTMRNAiMAX運載nNOS/siRNA轉染模型細胞)及Tat-N組(Tat-LK15運載NCsiRNA轉染模型細胞)，通過Q-PCR及Western blot檢測各組nNOS表達水平。 結果Tat-LK15與siRNA質量比為2 ∶1時可完全包裹siRNA，達到最佳交聯，此時其轉染效率為(84.4±3.9)%。當Tat-LK15劑量為20 μg(6.1 μmol·L-1)時才出現一定細胞毒性，細胞凋亡率高于對照組[(10.3±1.1)% vs (7.4±0.9)%，P<0.05]。造模后RGC-5細胞nNOS表達水平明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，Tat-S組nNOS mRNA及蛋白表達水平降低(P<0.05)，Tat-S組與Lipo-S組相比無差異(P>0.05)。 結論Tat-LK15能高效轉染siRNA，細胞毒性低，離體條件下可有效運載siRNA沉默nNOS的基因表達。

關鍵詞：細胞穿透肽；Tat；siRNA；基因治療；神經型一氧化氮合酶；神經病理性疼痛

神經元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)是脊髓、大腦等神經系統中催化L-精氨酸(L-Arg)產生重要的神經介質——一氧化氮(nitric oxide, NO)的關鍵酶，nNOS在神經病理性疼痛的發生、發展過程中具有重要作用[1]。通過RNA干擾技術抑制nNOS的過度表達是治療神經病理性疼痛的新途徑。小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)本身易被核酸酶降解、穩定性差、親水性強且帶負電，不易透過細胞膜進入胞內發揮作用。高效、安全siRNA遞送載體的缺乏嚴重限制了RNA干擾技術的臨床應用。

細胞穿透肽(cell penetrating peptides，CPPs)是一類由5~30個氨基酸組成的短肽，能將核酸片段、蛋白、多肽、噬菌體顆粒及磁性粒子等多種物質以非受體依賴的方式導入胞內，效率高、細胞毒性低，也不受細胞類型的限制[2]。CPPs與寡核苷酸形成的納米復合物穩定性良好，在血清中不易被降解，轉染效率甚至優于陽離子脂質體[3]。目前CPPs已在基因生物治療、腫瘤靶向藥物開發等領域逐步展現出誘人的前景，受到廣泛關注[4]。

Tat(transactivator of transcription)是人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基因編碼的反式轉錄激活因子，是當前最受矚目、研究最為深入的CPPs之一。Tat全長86個氨基酸，第49-57位(RKKRRQRRR)9個氨基酸是其發揮穿膜功能的核心序列[5]。Saleh等[6]發現該核心序列與膜活化多肽LK15(KLLKLLLKLLLKLLK)融合形成的細胞穿膜肽Tat-LK15運載siRNA轉染細胞的能力為單獨應用Tat時的2倍。因此，Tat-LK15或許可以作為一種良好的siRNA運載工具，明顯優化RNA干擾技術在治療神經病理性疼痛等方面的應用。

本研究在建立nNOS高表達的RGC-5視神經節細胞(retinal ganglion cell line,RGC-5)模型的基礎上，探討Tat-LK15運載siRNA沉默模型細胞nNOS基因表達的可行性，為后期在體應用RNA干擾技術抑制神經系統nNOS過度表達來治療神經病理性疼痛提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器DMEM-高糖培養基(Hyclone，Cat.No.SH30022.01B)，DMEM-低糖培養基(Hyclone，Cat.No.SH30021.01B)，胎牛血清(Hyclone，Cat.No.SH30087.01)，Opti-MEM(invitrogen，Cat.No.31985070)，青、鏈霉素(Hyclone，Cat.No. SH30010)，FAM-siRNA(上海吉瑪)，nNOS/siRNA和NCsiRNA(Sigma，美國)，Tat-LK15(廈門博欣生物)，LipofectamineTMRNAiMAX(invitrogen，13778075)，anti-nNOS(Abcam，ab76067)，Goat Anti-Rabbit IgG(Southern Biotech，4050-05)，倒置光學顯微鏡(OLYMPUS CKX41，U-CTR30-2)，倒置熒光顯微鏡(Leica，DMI6000B)，流式細胞儀(BD，FACS Calibur)，紫外分光光度計(艾本德，BioPhotometer plus)，SYBR Green qPCR SuperMix(Invitrogen，15596-026)，PCR儀ABI PRISM?7500(ABI)，凝膠成像系統Doc Gel 2000型(BIO-RAD)。

1.1.2細胞株與分組大鼠視神經節細胞RGC-5(廣州萊德爾生物)，制備高表達nNOS蛋白的RGC-5神經細胞模型。隨機分為5組：對照組(正常細胞)、模型組(nNOS高表達)、Tat-S組(Tat-LK15運載nNOS/siRNA轉染模型細胞)、Lipo-S組(Lipo運載nNOS/siRNA轉染模型細胞)及Tat-N組(Tat-LK15運載NCsiRNA轉染模型細胞)。

1.2方法

1.2.1siRNA序列與Tat-LK15nNOS雙鏈siRNA正義鏈：5′-CAAGUUCCGCCUCACGUAUdTdT-3′， 反義鏈：5′-AUACGUGAGGCGGAACUUGdTdT-3′；NCsiRNA正義鏈： 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。Tat-LK15序列：RKKRRQRRRGGGKLLKLLLKLLLK

LLK，純度95%， 分子量：3 283.4 g·mol-1。

1.2.2凝膠阻滯測定Tat-LK15/siRNA最佳交聯比siRNA質量恒定為100 ng，Tat-LK15和siRNA以質量比為1 ∶3、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1混合孵育20 min后上樣，20%非變性聚丙烯酰胺凝膠，電壓1.8 V·cm-1，低溫電泳2 h。之后將凝膠在0.5 mg·L-1的EB溶液中染色45 min，觀察并拍照。

1.2.3細胞培養和轉染細胞RGC-5細胞使用DMEM-高糖培養基(添加10%胎牛血清和1%青、鏈霉素)，置于含5%CO2、37 ℃的細胞培養箱內培養。轉染前1 d，取6孔板以細胞密度為每孔1×105個細胞接種，細胞培養至融合度為30%~50%時，去完全培養基，PBS洗2遍，加1 mL Opti-MEM培養基準備轉染。Opti-MEM培養基500 μL稀釋FAM-siRNA至終濃度50 nmol·L-1；Opti-MEM培養基500 μL稀釋Tat-LK15，Tat-LK15與FAM-siRNA質量比為2 ∶1(最佳交聯比)。孵育20 min后加到相應細胞培養板中，終培養基2 mL進行轉染，4 h后去轉染培養基，PBS洗2遍，加入完全培養基置于5%CO2、37 ℃細胞培養箱中。24 h后用熒光顯微鏡觀察轉染效果并拍照，流式細胞術檢測轉染效率，并與LipofectamineTMRNAiMAX (Lipo)5 μL相比較。

1.2.4流式細胞術檢測細胞轉染效率轉染24 h后收集細胞，重懸于預冷的1×結合緩沖液中使得其密度大約為每毫升1×106細胞，流式細胞儀檢測分析(激發波長為480 nm，發射波長為520 nm)，計數10 000個細胞計算陽性細胞百分率，所有步驟避光進行。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡率提前1 d取6孔板以細胞密度1×105/孔接種培養。取Tat-LK15 1、2.5、5、10和20 μg分別孵育細胞24 h，并與正常細胞進行對照。處理結束收集細胞，PBS重懸，細胞密度約每毫升1×106個細胞。取0.5 mL離心去上清，加入500 μL 1×結合緩沖液混勻。再依次加入1.25 μL Annexin V-FITC，10 μL PI輕輕混勻；室溫(18~24)℃避光反應15 min，1 h內檢測。

1.2.6制備高表達nNOS的細胞模型以缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation，OGD)和高鹽(濃度145 mmol·L-1)的處理方式制備nNOS高表達的細胞模型[7]。將厭氧培養產氣劑1包和厭氧指示劑放入方形培養罐制造缺氧模型，同時放入細胞培養板，以37 ℃、飽和濕度培養細胞。當指示劑在氧含量低于0.1%時(呈粉紅色)開始計時，24 h后缺氧結束，置入普通培養箱復氧48 h后進行相關檢測。

1.2.7Tat-LK15/siRNA對nNOS的沉默效率造模成功后取5組細胞，siRNA終濃度為50 nmol·L-1，TAT-LK15與siRNA交聯比為2 ∶1 (μg/μg)，Lipo 5 mL。在造模缺氧24 h后取細胞板置于普通培養箱開始復氧，同時進行轉染，復氧48 h(即轉染48 h)后收集細胞檢測nNOS mRNA和蛋白相對表達量。

1.2.8Q-PCR檢測nNOS mRNA收集細胞用TRIzol提取總RNA，紫外分光光度計測定總RNA純度，逆轉錄合成cDNA。nNOS上游引物：5′-GGACGCTGGTGTATTCATCA-3′，下游引物：5′- AAGGCGATGGACTCAGATCT-3′ 擴增片段長度120 bp；β-actin上游引物：5′- AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′，下游引物：5′- GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′ 擴增片段長度150 bp。PCR反應條件為：50 ℃ 熱啟動2 min，95 ℃預變性2 min后進入循環； 95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸讀板32 s，共50個循環，設置3個復孔。以SDS v1.4軟件對結果進行分析。

1.2.9Western blot檢測nNOS蛋白收集細胞，加入預冷的細胞裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將調整的樣品和上樣緩沖液按4 ∶1混合，煮沸5 min蛋白變性；按每泳道總蛋白50 μg上樣量進行SDS-PAGE電泳(分離膠濃度6%，濃縮膠濃度5%)，待溴酚藍電泳至接近分離膠底部時結束電泳。轉膜，5%脫脂牛奶封閉，與稀釋的anti-nNOS一抗(1 ∶1 000)4℃過夜，洗滌后再加入Goat anti-rabbit IgG二抗(1 ∶20 000)中37 ℃孵育1 h，漂洗后ECL顯色，暗室進行曝光、顯影和定影，經掃描后使用Gel-Pro analyzer分析軟件分析蛋白條帶灰度值，計算nNOS蛋白相對表達水平。

2結果

2.1Tat-LK15與siRNA最佳交聯比非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示，隨著Tat-LK15劑量增加，核酸條帶亮度逐漸變淡，當質量比為2 ∶1時電泳條帶完全消失。說明在質量比2 ∶1(μg/μg)時，Tat-LK15已能充分交聯siRNA(Fig 1)。

Fig 1Complex formation of Tat-LK15/siRNA electrophoresis

0: free siRNA; 1, 2, 3, 4, 5 respectively as complex formation Tat-LK15 and siRNA weight ratio of 1 ∶3, 1 ∶2, 1 ∶1, 2 ∶1 and 3 ∶1 (μg/μg).

2.2最佳交聯比時Tat-LK15/siRNA的轉染效率Tat-LK15與FAM-siRNA (50 nmol·L-1) 質量比為2 ∶1 (μg/μg) 時，流式細胞術檢測其轉染效率為(84.4±3.9)%，低于Lipo 5 μl的 (95.6±2.4)%(P<0.05)，見Fig 2、3。

Fig 2Transfection efficiency examined by flow cytometry

A:Blank group;B: Tat-LK15 and siRNA weight ratio of 2 ∶1(μg/μg);C:Lipo 5 μL.

Fig 3　Transfection of RGC-5 cells transfected with FAM-siRNA (Inverted fluorescence microscope×100)

*P<0.05vsblank group.

2.3Tat-LK15作用于細胞的凋亡率Tat-LK15劑量增加到20 μg (6.1 μmol·L-1) 時，才開始出現一定的細胞毒性，細胞凋亡率高于對照[(10.3±1.1)%vs(7.4±0.9)%，P<0.05]。說明其細胞毒性低，具有良好的生物安全性(Tab 1)。

2.4制備高表達nNOS的細胞模型經過缺氧缺糖高鹽處理后RGC-5細胞nNOS蛋白表達增高(P<0.05)；單純OGD處理nNOS表達無明顯變化(P>0.05)。因此，缺氧缺糖高鹽處理可以得到理想的nNOS高表達細胞模型(Fig 4、5)。

2.5Tat-LK15/siRNA的沉默效率與模型組相比，Tat-S組nNOS mRNA表達降低63.1%，蛋白表達降低62.9%，差異有統計學意義(P<0.05)。Tat-N組與模型組，Tat-S組與Lipo-S組nNOSmRNA及蛋白表達水平無差異(P>0.05)，見Fig 6、7、8。

3討論

神經病理性疼痛是神經系統結構受損或功能障礙所導致的疼痛，是目前亟待解決的臨床問題。nNOS在外周和中樞神經系統不同水平的過度表達是神經病理性疼痛形成、維持和發展的重要機制[8]。采用RNA干擾技術特異性沉默過度表達的nNOS則是治療神經病理性疼痛的新思路。

Fig 4Western blot of nNOS expression in RGC-5

cells exposed to OGD

Fig 5Relative expression of nNOS protein in

RGC-5 cells exposed to OGD

C:Normal cells;OGD:Exposed to oxygen-glucose deprivation; OGD+high NaCl: Exposed to oxygen-glucose deprivation and 145 mmol·L-1NaCl,*P<0.05vsC group.

Fig 6Relative expression of nNOS mRNA in RGC-5 cells interfered by Tat-LK15/siRNA

*P<0.05vsmodel group；#P<0.05vsTat-N group.

Fig 7Western blot of nNOS expression in RGC-5 cells in groups

Fig 8Western blot of quantification of Tat-LK15

mediated nNOS knockdown in RGC-5 cells

*P<0.05vsmodel group；#P<0.05vsTat-N group.

要將siRNA成功導入細胞內并發揮干擾效應，安全高效的基因載體是關鍵。常用的siRNA載體包括病毒載體系統和陽離子脂質體等，前者可能導致嚴重的免疫反應，并有潛在的病毒體內復制擴散的風險[9]；后者具有一定細胞毒性，干擾細胞代謝，動物實驗表明，在體使用陽離子脂質體可誘發肺部炎癥，甚至產生嚴重肺損傷[10]。而CPPs具轉染效率高、無毒、無免疫性的特點，可將包括siRNA在內的多種物質以非受體依賴、非經典內吞的方式直接導入胞內，且不受細胞類型的限制。有研究證實，CPPs介導的寡聚核苷(oligonucleotides，ONs)可有效地抑制目的基因的表達，且不會激發體內的免疫反應，彰顯了CPPs-Ons復合物在基因治療領域的希望和巨大潛力[11]。

HIV-Tat是現今研究最廣泛最深入的細胞穿透肽之一，Tat蛋白轉導域已被廣泛用于物質轉運方面的研究，如化學合成Tat融合蛋白，或構建包含Tat和目的蛋白基因的質粒載體產生Tat融合蛋白，導入宿主細胞或用于在體研究等[12]。值得注意的是，目前隨著Tat介導核酸跨膜轉運的研究逐步深入。Park等[13]發現Tat能夠攜帶質粒DNA穿過細胞膜進行基因轉染，并對細胞活性無明顯影響。Hyunmin 提出Tat-PAMAM融合蛋白可有效提高轉導效率，成功用于介導抗體和siRNA的傳送[14]。Eguchi等[3]通過結合一個雙鏈RNA結合域(double strand RNA Binding Domain，DRBD)修飾的Tat蛋白結構域(即Tat-DRBD融合蛋白)可以包裹siRNA上的負電荷骨架，防止其沉淀聚集，從而改善Tat對siRNA的轉染效率，甚至優于脂質體。Alain Pluen等證實Tat-LK15運載siRNA轉染細胞的能力為單獨應用Tat時的2倍。Arthanari等[15]則指出膜活化多肽LK15修飾的Tat(Tat-LK15)可高效地介導基因的傳遞，而細胞毒性在其濃度10 μmol·L-1時，即使用劑量的50倍才會開始出現。綜上可見，Tat相關載體核酸轉染效率高，細胞毒性低，在核酸轉運方面可能具有良好的應用前景。

本研究發現Tat-LK15與siRNA質量比為2 ∶1時可完全包裹siRNA。Tat-LK15/siRNA在此交聯比時轉染RGC-5細胞的效率可達(84.4±3.9)%，低于Lipo的(95.6±2.4)%。Tat-LK15孵育RGC-5神經細胞時，增加Tat-LK15的劑量并沒有引起明顯的細胞毒性，僅當劑量增至實驗劑量的10倍(20 μg)時才開始出現輕微的影響。構建nNOS高表達的細胞模型后，Tat-LK15/siRNA轉染模型細胞，其nNOS mRNA表達降低63.1%，蛋白表達降低62.9%，效果與Lipo相當，甚至略優于Lipo。由此可見，盡管Tat-LK15的細胞轉染效率略低于Lipo，但其細胞毒性極低，安全優勢突出，且最終的轉染效果并不亞于Lipo，可以作為運載siRNA干擾神經細胞nNOS表達的有效工具。本實驗結果也為后期探討Tat-LK15在體條件下運載siRNA干擾nNOS過度表達治療神經病理性疼痛打下提供了理論依據。

綜上所述，Tat相關載體作為最有應用前景的CPPs，在核酸轉運等方面已經得到廣泛的研究和關注，各類研究成果已逐步向臨床應用等方面轉化，相信經過不懈的努力，Tat相關載體做為有效的核酸轉運手段，將在疾病的基因治療等領域發揮不可低估的作用。

參考文獻:

[1]Tanabe M, Nagatani Y, Saitoh K, et al.Pharmacological assessments of nitric oxide synthase isoforms and downstream diversity of NO signaling in the maintenance of thermal and mechanical hypersensitivity after peripheral nerve injury in mice[J].Neuropharmacology, 2009, 56(3): 702-8.

[2]Nasrollahi SA, Taghibiglou C, Azizi E, et al.Cell-penetrating peptides as a novel transdermal drug delivery system[J].ChemBiolDrugDes, 2012, 80(5): 639-46.

[3]Eguchi A, Dowdy S F.Efficient siRNA delivery by novel PTD-DRBD fusion proteins[J].CellCycle, 2010, 9(3): 424-5.

[4]Jafari M, Chen P.Peptide mediated siRNA delivery[J].CurrTopMedChem, 2009, 9(12): 1088-97.

[5]Vives E, Brodin P, Lebleu B.A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus[J].JBiolChem, 1997, 272(25): 16010-7.

[6]Saleh A F, Aojula H, Arthanari Y, et al.Improved Tat-mediated plasmid DNA transfer by fusion to LK15 peptide[J].JControlRelease, 2010, 143(2): 233-42.

[7]Scorziello A, Pellegrini C, Secondo A, et al.Neuronal NOS activation during oxygen and glucose deprivation triggers cerebellar granule cell death in the later reoxygenation phase[J].JNeurosciRes, 2004, 76(6): 812-21.

[8]Zhou L, Zhu D Y.Neuronal nitric oxide synthase: structure, subcellular localization, regulation, and clinical implications[J].NitricOxide, 2009, 20(4): 223-30.

[9]Walther W, Stein U.Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human diseases[J].Drugs, 2000, 60(2): 249-71.

[10]Dokka S, Toledo D, Shi X, et al.Oxygen radical-mediated pulmonary toxicity induced by some cationic liposomes[J].PharmRes, 2000, 17(5): 521-5.

[11]Andaloussi S E, Lehto T, Mager I, et al.Design of a peptide-based vector, PepFect6, for efficient delivery of siRNA in cell culture and systemicallyinvivo[J].NucleicAcidsRes, 2011, 39(9): 3972-87.

[12]曲恒燕，劉譯源，李媛媛，等. TAT-tCNTF融合蛋白對Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞損傷的保護作用[J]. 中國藥理學通報，2010，26(4)：442-6.

[12]Qu H Y, Liu Z Y,Li Y Y,et al. Protective effects of TAT-tCNTF fusion protein on SH-SY5Y cells induced by β-amyloid peptide(25-35)[J].ChinPharmacolBull，2010，26(4)：442-6.

[13]Park Y J, Liang J F, Ko K S, et al.Low molecular weight protamine as an efficient and nontoxic gene carrier:invitrostudy[J].JGeneMed, 2003, 5(8): 700-11.

[14]Kang H, DeLong R, Fisher M H, et al.Tat-conjugated PAMAM dendrimers as delivery agents for antisense and siRNA oligonucleotides[J].PharmRes, 2005, 22(12): 2099-106.

[15]Arthanari Y, Pluen A, Rajendran R, et al.Delivery of therapeutic shRNA and siRNA by Tat fusion peptide targeting BCR-ABL fusion gene in chronic myeloid leukemia cells[J].JControlRelease, 2010, 145(3): 272-80.

網絡出版時間：2015-1-9 13:37網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.026.html

Delivery of therapeutic siRNA by Tat-LK15 targeting

nNOS fusion gene in RGC-5 cells

PENG Jie, RAO Yun, LU Jian-hua, WU Hao-peng, YANG Xiu-huan, TU Wei-feng

(DeptofAnesthesiology,GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou510010,China)

Abstract：AimTo investigate the potential application of a non-viral gene carrier Tat-LK15 for delivering siRNA targeting nNOS in vitro, which provides evidence of Tat-LK15 mediating siRNA targeting nNOS in vivo for treatment of neuropathic pain. Methods1. Tat-LK15 was mixed with siRNA, then the mixture was analyzed the best ratio by Gel retardation. The transfection efficiency of FAM-siRNA mediated by Tat-LK15 on RGC-5 cells was examined by Flow Cytometry. The apoptosis ratio of RGC-5 was identified by Flow Cytometry 24h after treated with the different doses of Tat-LK15 (1, 2.5, 5, 10 and 20 μg). 2. The model of RGC-5 cell overexpression of nNOS protein was prepared. 3. RGC-5 cells were randomly divided into 5 groups: control group,model group, Tat-S group (Tat-LK15 mediate nNOS/siRNA transfection model cell), Lipo-S group (LipofectamineTMRNAiMAX mediate nNOS/siRNA transfection model cell) and Tat-N group (Tat-LK15 mediate NCsiRNA transfection model cell). Real-time Quantitative polymerase chain reaction(Q-PCR) and Western blot were used to evaluate nNOS expression level assay. ResultsIt indicated that the Tat-LK15/siRNA complex completely formed at the weight ratio of 2 ∶1 (μg/μg), and the transfection efficiency was (84.4±3.9)%. It caused cotytoxicity when Tat-LK15 dose was 20 μg (6.1 μmol·L-1), and the apoptosis rate more than control group[(10.3±1.1)% vs (7.4±0.9)%, P<0.05]. The nNOS protein level of RGC-5 cells was significantly elevated after modeling. Compared with that of model group, Tat-LK15/siRNA efficiently inhibited the expression of nNOS at transcriptional level or protein leve1 of Tat-S group (P<0.05), and there was no significant difference of the efficiency inhibited between Tat-S group and Lipo-S group. ConclusionsTat-LK15’ advantage is with high efficiency, low cytotoxicity. The Tat-LK15 can deliver siRNA targeting nNOS in vitro efficiently and safely.

Key words：cell penetrating peptides (CPPs); Tat; siRNA; gene therapy; nNOS; neuropathic pain

通訊作者陸建華(1966-)，男，博士后，主任醫師，，研究方向：急慢性疼痛基因治療，Tel：020-88653504，E-mail: lujianh@aliyun.com

作者簡介：彭捷(1980-)，男，博士，主治醫師，研究方向：急慢性疼痛的基因治療，E-mail: excelsiorscholar@163.com;

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81100817,81371233)

收稿日期:2014-10-21,修回日期:2014-11-22

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2015)02-0278-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.026