GIK液對腦死亡豬供體心肌能量代謝的影響

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GIK液對腦死亡豬供體心肌能量代謝的影響

吳國俊1，楊紹軍2

(1.川北醫學院第二臨床學院，南充市中心醫院胸心外科，四川南充637000; 2.昆明醫科大學第二附屬醫院胸心外科，云南昆明650101)

【摘要】目的:本研究旨在通過緩慢顱內加壓法建立豬腦死亡模型并探討GIK液干預治療對豬腦死亡心臟供體的保護作用。方法: 12頭健康版納小耳豬隨機分為2組(n =6)，對照組(S組)和實驗組(G組)，檢測兩組血清鉀、游離脂肪酸和乳酸、血糖和心肌能量代謝相關酶。結果:對照組和實驗組在腦死亡后血糖急劇升高，腦死亡后與腦死亡前相比血糖有顯著差異(P＜0.05)，腦死亡后實驗組血糖略低于對照組，兩組相比無顯著差異(P＞0.05)。血鉀、乳酸脫氫酶(LDH)、Na+-K+-ATP酶實驗組明顯高于對照組，兩組相比有顯著差異(P＜0.05)。游離脂肪酸在腦死亡后1 h兩組相比有顯著差異(P＜0.05)。結論:應用改進的緩慢間斷顱內加壓法建立豬腦死亡模型，比較符合臨床腦死亡的發展過程，經有效的呼吸和循環支持，腦死亡狀態可穩定維持。GIK液能使豬腦死亡后血清乳酸和血鉀升高，但不引起高鉀血癥，同時能抑制游離脂肪酸的釋放。應用緩慢間斷顱內加壓法建立豬腦死亡模型能引起血糖顯著升高，但GIK不會引起豬腦死亡后血糖升高。GIK使豬腦死亡后心肌組織糖酵解途徑中的關鍵酶乳酸脫氫酶(LDH)的含量增多，Na+-K+-ATP酶活性增強。通過提高心肌能量代謝底物及相關酶的含量，并促進能量代謝產物的轉化來改善心肌細胞能量代謝，增強心功能。

【關鍵詞】腦死亡;心肌保護; GIK液;心肌能量代謝

心臟移植是治療終末期心臟病最有效的措施［1］，然而器官移植的最大障礙是供體器官的短缺，由于供體的缺乏，供體的保護顯得尤為重要。腦死亡后機體發生一種嚴重的病理生理狀態，對心臟的損害近年來備受關注。急性腦死亡后可引起供體血流動力學的劇烈改變以及循環中生化指標的紊亂并造成心肌形態學的損傷［2］。本實驗采用緩慢間斷顱內加壓法建立版納小耳豬的腦死亡模型，探討腦死亡模型建立的方法，探索腦死亡模型建立過程給予GIK液干預性治療以及腦死亡狀態維持過程中的血液動力學、能量代謝底物、產物、相關酶變化的規律。

1　材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑、儀器

健康版納小耳豬(25±5)kg，雌雄不限，12頭，正常飲食，昆明醫科大學動物實驗中心提供。Porcine HK SLISA試劑盒、Pine LDH SLISA試劑盒、Porcine CACT SLISA試劑盒、Porcine ACS SLISA試劑盒、Porcine CS SLISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。簡易呼吸機(江西特力TKR-200C動物呼吸機)，420F生物機能實驗系統(都泰盟科技有限公司)。

1.2實驗分組及方法

1.2.1分組方法及腦死亡模型建立實驗使用健康版納小耳豬12頭，(25±5)kg，雌雄不限，隨機分為兩組，對照組6頭(S組)，GIK液治療組6頭(G 組)。用3％戊巴比妥鈉注射液(2～5 mg/kg)全身麻醉，氣管切開及插管，接呼吸機輔助呼吸。顱骨矢狀線外側0.2～0.5 cm處鉆一個直徑約1 cm的孔，一根Foley20F氣囊導尿管由此孔置入硬腦膜下腔內，緩慢向氣囊導尿管內注入25～40 mL生理鹽水，逐漸膨脹氣囊，增加顱內壓，建立腦死亡模型。

1.2.2腦死亡的判定方法目前，關于腦死亡的判定標準各國沒有一個統一的標準，我們參考國內外相關文獻［3-4］，擬定本次實驗采用的豬腦死亡判定標準是: (1)深昏迷:排除麻醉，低體溫等可逆性昏迷的原因; (2)瞳孔:瞳孔中度或完全擴大，光反射全部消失; (3)角膜反射:角膜混濁，角膜反射消失; (4)呼吸:在脫離呼吸機的情況下無自主呼吸; (5)阿托品實驗陰性:靜脈注射阿托品l mg監測心率15 min無加快(心率增加20％～40％為陽性)。

1.2.3實驗組干預方法和對照組處理方法實驗組在腦死亡模型建立前30 min經深靜脈給予25％ GIK液治療(1.5 mL/kg·h)，腦死亡后給予0.9％生理鹽水和多巴胺維持收縮壓90 mmHg以上，MAP 為60 mmHg以上。對照組僅給予0.9％生理鹽水和多巴胺維持收縮壓90 mmHg以上，MAP為60 mm-Hg以上。兩組實驗過程中除采用GIK液干預外，其他都相同。

1.3觀察指標

1.3.1能量代謝原料及產物測量腦死亡后-1 h、0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h監測微量血糖。建立腦死亡模型后0 h、1 h、5 h、10 h均采取靜脈血6 mL，在室溫下放置2 h，用離心機以3 000 r/min離心20 min，取上清液，檢測游離脂肪酸、乳酸濃度。

1.3.2心肌能量代謝相關酶檢測能量代謝在腦死亡模型維持10 h后，在心臟不停跳的情況下行正中開胸術取左心室心內膜下心肌組織，用4℃生理鹽水沖洗干凈，切成0.5 cm×1.0 cm大小的組織4塊放入EP管中，存放于-80℃冰箱。待測心肌組織己糖激酶(HK)和乳酸脫氫酶(LDH)、肉堿脂酰轉移酶(CACT)和脂酰輔酶A合成酶(ACS)、檸檬酸合成酶(CS)的含量，Na+-K+-ATP酶和Ca2 +-Mg2 +-ATP酶的活性。

1.4統計學分析

2　結果

2.1一般情況

通過緩慢顱內加壓法建立豬腦死亡模型，12頭豬術中手術成功率為100℅，術后10 h模型成活率83.3℅，建模過程中死亡2頭，用于實驗研究的版納小耳豬有10頭。1例因頸動脈導管脫落大量出血導致失血性休克而死亡，另1例在腦死亡模型建立后因無尿、頻發室顫搶救無效死亡。

2.2血糖檢測

通過緩慢顱內加壓建立腦死亡模型，實驗組和對照組在腦死亡時兩組血糖均急劇升高，兩組在腦死亡0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h血糖較腦死亡前1 h明顯升高，腦死亡后的血糖與腦死亡前相比有顯著差異(P＜0.05)。見表1。

表1　對照組和實驗組血糖變化(mmol/L，±s，n =5)

表1　對照組和實驗組血糖變化(mmol/L，±s，n =5)

注: P＜0.05，兩組腦死亡前與腦死亡后相比有顯著差異。

時間　S組　G組死亡前1 h　4.42±0.43　5.12±0.45 0 h　9.7±1.6　9.5±2.2 1 h　11.5±2.1　10.4±1.9 2 h　10.3±2.8　8.6±2.5 4 h　11.8±4.0　7.0±1.4 6 h　9.8±3.9　7.1±1.8 8 h　8.6±1.9　6.9±0.9 10 h　8.1±2.3　6.3±0.7

2.3乳酸檢測

實驗組(G)和對照組(S)在腦死亡0 h、1 h、5 h、10 h分別采血檢測乳酸濃度，兩組各時間點乳酸濃度相比，無明顯差異，無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2　對照組和實驗組乳酸變化(mmol/L，±s)

表2　對照組和實驗組乳酸變化(mmol/L，±s)

時間　S組　G組0 h　1.92±0.36　2.15±0.09 1 h　1.96±0.12　2.28±0.34 5 h　2.14±0.24　2.35±0.26 10 h　2.24±1.25　2.43±0.34

2.4游離脂肪酸檢測

在腦死亡0 h、1 h、5 h、10 h分別采血檢測游離脂肪酸濃度，比較兩組各時間點游離脂肪酸的差異。兩組在腦死亡后1 h游離脂肪酸相比有顯著差異(P＜0.05)，在0 h、5 h、10 h兩組相比無顯著差異(P＞0.05)，見表3。

表3　對照組和實驗組游離脂肪酸變化(μmol/L，±s，n =5)

表3　對照組和實驗組游離脂肪酸變化(μmol/L，±s，n =5)

P＜0.05，與對照組相比有顯著差異。

時間　S組　G組0 h　556.69±132.44　520.31±149.50 1 h　644.93±189.8　424.09±83.22 5 h　718.99±182.3　465.4±155.2 10 h　653.10±177.50　560.28±236.10

2.5心肌組織能量代謝酶檢測

腦死亡后10 h在心臟不停跳下取左心室心肌組織，用ELISA(酶聯免疫吸附劑測定)分析試劑盒檢測酶的含量。LDH與對照組相比有顯著差異(P＜0.05)。見表4。

表4　對照組和實驗組HK、LDH、CACT、ACS、CS變化(U/L，±s，n =5)

表4　對照組和實驗組HK、LDH、CACT、ACS、CS變化(U/L，±s，n =5)

P＜0.05，LDH與對照組相比有顯著差異。

酶類　G組　S組ACS　334.56±138.53　240.14±58.78 CS　39.45±5.76　34.66±8.83 CACT　3.56±0.60　3.22±0.48 LDH　11.42±0.96　9.48±0.90 HK　3.35±0.46　2.93±0.22

2.6心肌組織Na+-K+-ATP酶和Ca2 +-Mg2 +-ATP酶檢測

腦死亡后10 h在心臟不停跳下取左心室心肌組織，用生化法Na+-K+-ATP酶和Ca2 +-Mg2 +-ATP酶的活性，并行蛋白定量。Na+-K+-ATP酶與對照組相比酶活性明顯升高，兩組相比有顯著差異(P＜0.05)。Ca2 +-Mg2 +-ATP酶與對照組相比酶活性略升高，但兩組相比無顯著差異(P＞0.05)。見表5。

表5　對照組實驗組Na+-K+-ATP酶和Ca2 +-Mg2 +-ATP酶的變化(U/mgprot，±s，n =5)

表5　對照組實驗組Na+-K+-ATP酶和Ca2 +-Mg2 +-ATP酶的變化(U/mgprot，±s，n =5)

P＜0.05，Na+-K+-ATP酶與對照組相比有顯著差異。

酶類　G組　S組Na+-K+-ATP酶1.63±0.51　0.99±0.16 Ca2 +-Mg2 +-ATP 1.91±0.26　1.76±0.50

2.7GIK液對腦死亡豬供體血鉀的影響

實驗組(G)和對照組(S)在腦死亡0 h、1 h、5 h、10 h分別采血檢測血鉀濃度，比較兩組各時間點血鉀濃度。腦死亡0 h、10 h兩組血鉀相比，實驗組血鉀濃度明顯高于對照組，有顯著差異(P＜0.05)。見表6。

表6　對照組和實驗組血鉀變化(mmol/L，±s，n =5)

表6　對照組和實驗組血鉀變化(mmol/L，±s，n =5)

P＜0.05，與對照組相比有顯著差異。

時間　S組　G組0 h　2.28±0.31　3.01±0.22 1 h　2.53±0.34　2.87±0.43 5 h　2.41±0.37　3.04±0.52 10 h　2.48±0.31　3.15±0.28

3　討論

腦死亡后機體發生一系列復雜的病理生理反應，嚴重影響供體心臟的功能。腦死亡后因交感神經系統的作用，導致大量兒茶酚胺釋放入血液循環，“兒茶酚胺風暴”使收縮壓、舒張壓急劇升高。腦死亡后40～60 min，心臟收縮力從高血流動力學的峰尖降至明顯低于正常水平以下，且實驗過程中不會再恢復［5-7］。隨后血壓繼續下降，心肌收縮力減退，心輸出量減少，出現心力衰竭。腦死亡后抗尿激素減少［8］，機體尿量增多伴隨著血鉀的丟失。鉀是維持細胞膜靜息電位的物質基礎，靜息膜電位主要決定于細胞膜對鉀的通透性和膜內外鉀濃度差。細胞外液鉀明顯降低時，膜對K+的通透性降低，K+隨化學濃度差移向胞外的力受膜的阻擋，達到電化學平衡所需的電位差相應減小，即靜息膜電位的絕對值減小，與閾電位的差距減小，心肌興奮性升高，心率增快。給予GIK干預性治療，可為細胞外液補充外源性K+。GIK液中的胰島素刺激心肌細胞Na+-K+-ATP酶，促進心肌細胞攝取K+，從而穩定細胞膜的極化狀態，減少心律失常的發生［9］。迷走神經末梢釋放乙酰膽堿和竇房結細胞膜M受體結合，激活細胞膜K+通道，結果最大復極電位變得更負，竇房結的自律性降低，心率變慢［10］。因此，GIK能有效地減慢心率，減少心律失常的發生，改善心肌功能，增加心輸出量。心力衰竭時心肌細胞出現血供和代謝需求之間的平衡打破，心肌出現一系列病理生理變化，包括高能磷酸鹽合成減少、能量代謝關鍵酶的活性降低、線粒體數目和功能的改變等［11-12］。心肌能量代謝作為心力衰竭的一種新思路新策略，對心衰的常規用藥及療法進行能量代謝角度分析。通過調節異常的心肌能量代謝過程，輔助心衰的治療，有望改善衰竭心肌的功能。心肌利用產生能量的物質有脂肪酸、糖、乳酸、氨基酸和酮體等，在正常成年人主要產能物質是脂肪酸，約占2/3，另1/3來自糖、乳酸、氨基酸和酮體［13］。腦死亡后隨著心功能逐漸下降，心輸出量減少，心肌缺血缺氧，心臟處于“能量饑餓狀態”［14］。心力衰竭時心肌脂肪酸氧化減少、葡萄糖利用增加［15］，這種能量代謝的改變是心肌的自我保護機制。脂肪酸利用減少，脂質在心臟沉積并造成脂毒性心臟異常［16］，糖酵解代謝增強，乳酸產生增多造成酸中毒，心功能繼之惡化，因此改善心肌能量代謝顯得尤為重要。為了探索腦死亡后給予GIK干預治療，來探討心肌組織中能量代謝變化，本實驗檢測了豬腦死亡后左心室組織中能量代謝關鍵酶LDH、HK、ACS、CACT、CS含量的變化。GIK可促進心肌細胞糖酵解［17］，糖酵解代謝增強可使乳酸產生增多造成酸中毒［18］。乳酸脫氫酶(LDH)使乳酸變為丙酮酸而進入檸檬酸循環提供能源，它的活性的強弱可以反應心肌細胞有氧代謝功能的強弱［19］。本實驗檢測乳酸脫氫酶(LDH)含量實驗組高于對照組，兩組相比有顯著差異(P＜0.05)。這說明LDH可將糖酵解產生一部乳酸轉化為丙酮酸，可以避免乳酸越堆越多。由檢測結果可以看出實驗組的乳酸略多于對照組，但兩組相比無顯著差異(P＞0.05)。腦死亡后機體釋放大量的兒茶酚胺，兒茶酚胺可升高血漿游離脂肪酸(plasma free fatty acid，FFA)，大量的FFA會對缺血心肌生產毒性作用，加重心肌功能障礙［20］。GIK液中的胰島素既可促進細胞攝取和利用葡萄糖，又可降低血中FFA水平，GIK液給缺血心肌提供能量［21］。本實驗檢測血漿游離脂肪酸(FFA)顯示，在腦死亡后1 h實驗組的FFA明顯少于對照組，兩組相比有顯著差異(P＜0.05)。GIK液中胰島素既可降低血液循環中的FFA水平，還可抑制缺血心肌細胞攝取和利用FFA，從而使缺血心肌免受FFA的細胞毒效應［22］。同時GIK中的胰島素促進缺血心肌的功能恢復，在缺少胰島素的情況下可加重泵功能的損害［23］。本實驗檢測在腦死亡前實驗組和對照組的血糖分別是(5.12±0.45)mmol/L和(4.42±0.43)mmol/L，當行顱內加壓腦死亡，血糖急劇升高。對照組腦死亡后各個時間點的血糖在(8.1±2.3)mmol/L～(11.8 ±4.0)mmol/L之間，實驗組腦死亡后各個時間點的血糖在(6.3±0.7)mmol/L～(10.4±1.9)mmol/L之間，兩組腦死亡后的血糖與腦死亡前相比有顯著差異(P＜0.05)。實驗組腦死亡后各個時間點的血糖均低于對照組，腦死亡后4 h的血糖實驗組明顯低于對照組，兩組相比有顯著差異。本課題結果顯示，給予GIK液干預治療，給心肌細胞能量代謝提供糖原，而不會引起高血糖發生。

GIK治療簡易、廉價、無特殊禁忌證、容易廣泛推廣，其促進缺血心肌細胞攝取和利用葡萄糖，減少FFA的釋放，提高心肌細胞相關酶的含量，能減慢心率，減少心律失常的發生，改善心肌功能，增加心輸出量。GIK液的主要成分胰島素是一種多項功能藥物，在臨床上應用較為廣泛，價格便宜。所以，深入探討GIK液在心力衰竭治療中的保護作用，將其發展改善，可以進一步拓展心臟疾病方面的治療領域。

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(學術編輯:付茂勇)

Effects of GIK on myocardial energy metabolisma donor heart with the brain dead pig

WU Guo-jun1，YANG Shao-jun2

(1.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery，Nanchong Central Hospital，The Second Clinical School of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan; 2.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery，The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College，Kunming 650101，Yunnan，China)

【Abstract】Objective: To aim to establish the pig brain deadth model used slowly increasing intracranial pressure which was and investigate GIK intervention the protective effects on pig brain death donor heart.Methods: 12 healthy Xishuangbanna Miniature pigs were randomly divided into two groups including the control group (group S，n =6)and the experimental group (group G，n =6).Serum potassium，free fatty acids，lactic acid，blood sugar and key enzyme of myocardial energy metabolism were detected.Results: Blood sugar was remarkably increased between control group and experimental group after brain death.Blood glucose was significant difference between before and after brain death (P＜0.05).Blood glucose in the experimental group was slightly lower than that in control group after brain death，which was no significant difference between two groups (P＞0.05).Potassium，lactate dehydrogenase (LDH)and Na+-K+-ATP enzyme in the experimental group were significantly higher compared with the control group (P＜0.05).Free fatty acids were significantly different difference in the two groups after brain death 1 h (P＜0.05).Conclusion: The pig brain death model established by slowly improved intermittent intracranial pressure is more in line with the development of clinical brain death and brain death can be stably maintained through effective respiratory and circulatory support.GIK solution enables increased serumbook=345,ebook=78lactate and potassium，but does not cause hyperkalemia，and can inhibit the release of free fatty acids after，pig brain death.Blood sugar is increased in the pig brain death model used slowly increased intermittent intracranial pressure but GIK does not cause blood sugar after pig brain death.GIK can increase the level of key enzyme lactate dehydrogenase (LDH)and the activity of Na+-k+atpase in the glycolytic pathway of myocardial tissue after pig brain death.It is feasible to improve myocardial energy metabolism and enhance cardiac function by increasing the level of myocardial energy metabolism and related enzyme substrates and promoting the transformation of energy metabolites.

【Key words】Brain dead; Myocardial protection; Glucose-insulin-potassium solution; Myocardial energy metabolism.

通訊作者:楊紹軍，E-mail: yangsj8@Hotmail.com

作者簡介:吳國俊(1973-)，男，四川南充人，主治醫師，主要從事胸心血管外科。

基金項目:云南省衛生科技基金資助項目((2009NS076)

收稿日期:2014-10-27

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.03.17

【文章編號】1005-3697(2015)03-0344-05

【中圖分類號】R337

【文獻標志碼】A

網絡出版時間: 2015-6-19 17∶39網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150619.1739.014.html