MicroRNA-34c在人腦膠質瘤中的表達及臨床意義

論著

MicroRNA-34c在人腦膠質瘤中的表達及臨床意義

武震東任洪波孫志強劉斌張素蘭焦保華

項目來源：河北省醫學科學研究重點課題(編號：ZD20140280)

作者單位： 050000石家莊市，河北醫科大學第二醫院神經外科[武震東(現工作單位為河北省邯鄲市中心醫院神經外科)、焦保華]；河北省邯鄲市中心醫院神經外科(任洪波、孫志強、劉斌、張素蘭)

E-mail：jiaobh2000@163.com

【摘要】目的探討miRNA-34c在人腦膠質瘤組織中的表達情況及臨床意義。方法應用定量PCR方法對18例WHO分級Ⅱ～Ⅳ級的甲醛固定石蠟包埋的腦膠質瘤標本和外傷或腦出血患者內減壓手術獲得的5例腦組織標本分別進行miR-34c-3p和miR-34c-5p含量的檢測，比較不同級別膠質瘤和正常腦組織中miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達差異，分析miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達和膠質瘤惡性程度的相關性。結果與正常腦組織相比，膠質瘤中miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達皆顯著減少(P<0.05)，而且miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達隨著膠質瘤級別或惡性程度的增加分別減少，呈顯著的負相關(miR-34c-3p的spearman相關系數=-0.856，P<0.01；miR-34c-5p的spearman相關系數=-0.767，P<0.01)。結論MiR-34c在人腦膠質瘤細胞中的表達顯著降低，而且表達隨著腫瘤分級或惡性程度的增高而減少，與膠質瘤級別的升高呈顯著的負相關。MiR-34c在膠質瘤的進展中有重要的意義，可作為腦膠質瘤臨床分級的重要指標。

【關鍵詞】膠質瘤；microRNA；miR-34c-3p；miR-34c-5p

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.20.003

通訊作者：焦保華，050000河北醫科大學第二醫院神經外科；

【中圖分類號】R 739.4

收稿日期：(2005-03-11)

The expression and clinical significance of miRNA-34c in human brain glioma tissuesWUZhendong*,RENHongbo,SUNZhiqiang,etal.*DepartmentofNeurosurgery,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of miRNA-34c in human brain glioma tissues.MethodsThe expression levels of miR-34c-3p and miR-34c -5p in 18 brain glioma specimens at WHO grade Ⅱ～Ⅳ class and 5 specimens got from patients with trauma or cerebral hemorrhage were detected by quantitative PCR. Moreover the differences of expression levels of miR-34c-3p and miR-34c -5p between different grade gliomas and normal brain tissue were compared,and the correlation between the expressions of miR-34c-3p, miR-34c-5p and malignant degree of gliomas was analyzed.ResultsAs compared with those in normal brain tissue,the expression levels of miR-34c-3p and miR-34c-5p in gliomas were significantly decreased (P<0.05),moreover, there was a significant negative correlation between expressions of miR-34c-3p,miR-34c-5p and malignant degree or grade of gliomas (r=-0.856,r=-0.767,respectively,P<0.01).ConclusionThe expression levels of miRNA-34c are significantly decreased in human brain glioma cells,moreover, there is a significant negative correlation between expressions of miR-34c-3p , miR-34c-5p and malignant degree or grade of tumor. MiRNA-34c plays an important role in the development of glioma,thus it can be regarded as an important index for clinical classification of brain glioma.

【Key words】glioma；microRNA；miR-34c-3p；miR-34c-5p

神經膠質瘤是中樞神經系統最為常見的惡性腫瘤，也是最難治療的腫瘤之一。常規的臨床治療方法如化療、手術切除和放療效果欠佳[1]，而膠質瘤組織的浸潤性生長卻常常使患者在出現癥狀后很快面臨腫瘤轉移而導致死亡的威脅，目前從基因水平尋找惡性膠質瘤防治的新途徑成為研究的熱點。MicroRNAs(miRNAs)是一種約22個核苷酸長度非編碼單鏈小RNA，其本身不具有翻譯蛋白質的功能, 而是通過與mRNA 的3’端非翻譯區(3’UTR)的堿基序列互補配對在轉錄后水平調控靶基因表達。MiRNA與mRNA能進行完全或近乎完全的互補配對，誘導對mRNA 的切割降解，而部分堿基配對則導致功能蛋白質的轉錄抑制[2]。MiRNAs能參與一系列重要的生物學行為, 例如細胞分化、細胞增殖與凋亡、應激反應等[3]。同時顯示出miRNAs與癌癥的形成關系密切，原因是它參與了細胞的增殖、凋亡，這兩個與人類惡性腫瘤的發生、進展密切相關的兩個進程。亦有報道與正常組織比較，惡性腫瘤組織的miRNAs異常表達[4]。本實驗主要研究microRNA-34c在膠質瘤組織和細胞系中的表達情況。

1資料與方法

1.1一般資料膠質瘤組織標本和正常腦組織標本均來自于河北醫科大學第二醫院神經外科。共收集2011年1至6月期間甲醛固定石蠟包埋的腦膠質瘤標本18例，正常腦組織標本5例。所有標本病理結果均經病理科證實，根據WHO的病理分級標準，分為Ⅱ～Ⅳ級，其中Ⅱ級膠質瘤共6例，包括星形細胞瘤2例、室管膜瘤2例、少突膠質細胞瘤2例。Ⅲ級膠質瘤6例，其中間變性星形細胞瘤4例、間變性少突膠質細胞瘤2例。Ⅳ級膠質瘤6例，均為多形性膠質母細胞瘤。腦出血、腦外傷患者行內減壓手術而得到的正常腦組織5例作為對照組。

1.2實驗方法利用Trizol(Invitrogen， USA)提取膠質瘤組織及正常腦組織總RNA。取1 μg總RNA做stem-loop引物的逆轉錄反應。miR-34c-3p和 miR-34c-5p的共同逆轉錄引物為：miRNA R：5’CTCAACTGGTGTCGTGGA；PCR引物為：hsa-miR-34c-3p F：5’ACACTCCAGCTGGGAATCACTAACCACACGG；hsa-miR-34c-5p F：5’ACACTCCAGCTGGGAGGCAGTGTAGTTAGCTGAT；內參U6的引物為：U6-F：5’CTCGCTTCGGCAGCACA；U6-R：5’AACGCTTCACGAATTTGCGT。所有引物均為上海生工合成。使用的定量PCR儀為ABI PRISMR 7500 Sequence Detection System。PCR擴增程序如下：95℃變形5 min，隨后95℃作用15 s，65℃作用15 s，72℃作用32 s，共進行40個循環，在溫度60℃～95℃進行融解曲線分析，每個樣本重復3次。

1.3統計學分析以U6做為內參，以2-ΔΔCT表示各種miRNA的相對表達量，應用SPSS 16.0統計軟件，定量PCR采用ANOVA單因素方差分析，miR-34c-3p、miR-34c-5p與病理分級的相關性采用Spearman等級相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1MiR-34c在人腦膠質瘤中的表達情況定量PCR檢測結果顯示，在18份人腦膠質瘤標本中，miR-34c-3p和miR-34c-5p穩定表達。在經過和U6內參相比較，以正常腦組織全RNA作為對照，正常腦組織中miR-34c-3p和miR-34c-5p的水平分別是WHO Ⅱ級膠質瘤標本的1.84倍和7.3倍；分別是WHO Ⅲ級膠質瘤標本的7.8倍和26.1倍；分別是WHO Ⅳ級膠質瘤標本的49.6倍和208.8倍；差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1實時定量PCR檢測人腦膠質瘤中miRNA-34c的表達；與對照組比較，*P<0.05

2.2MiR-34c在膠質瘤中表達與病理分級相關性分析我們用Spearman等級相關分析分析了miR-34c-3p和miR-34c-5p在膠質瘤中表達的相關性，發現其表達和膠質瘤標本WHO病理分級存在負相關性(r=-0.856和-0.767，P<0.01)。見圖2。

圖2miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p在不同級別膠質瘤中的表達及其與腫瘤惡性程度的相關性

3討論

miRNAs是一種約22個核苷酸長度非編碼單鏈小RNA，其本身不具有翻譯蛋白質的功能,而是通過與mRNA的3’端非翻譯區(3’UTR)的堿基序列互補配對在轉錄后水平調控靶基因表達。最近有文章報道miRNAs與腫瘤的關系，特別是與腫瘤惡性度及腫瘤病人的預后有密切關系[5]。

miRNA-34家族由miR-34a,miR-34b and miR-34c組成，并且在不同的物種中具有高度的保守性[6]。最近有報道miR-34a-c是腫瘤抑制因子p53的直接轉錄靶點，參與p53和Notch信號通路的調控，具有腫瘤抑制的特性[7]。已有報道miR-34c在許多不同的惡性腫瘤中低表達，但是miR-34c在膠質瘤臨床標本中的表達情況如何，以及它潛在的可能抑制腫瘤生長的作用還不得而知，miR-34c有兩個成熟的單鏈，miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p[8]。曾有報道，組織中miRNAs的表達水平不受甲醛固定石蠟包埋的影響[9,10]，因此，我們試圖檢測在人腦膠質瘤石蠟標本中miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表達水平。

本實驗采用定量PCR的方法分析了18例甲醛固定石蠟包埋的人腦膠質瘤和5例正常腦組織miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表達，試圖發現miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p在人腦膠質瘤的表達與膠質瘤惡性程度之間的關系。經統計學分析我們發現，人腦膠質瘤中miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表達顯著低于正常腦組織(P<0.05)，這說明miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p能與人腦膠質瘤的發生、發展密切相關，在其中發揮重要的生物學作用。另外人腦膠質瘤Ⅱ～Ⅳ級中miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表達存在差異，隨膠質瘤級別的增高組織中miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表達顯著降低，相關性統計表明miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表達水平與人腦膠質瘤的病理級別顯著相關，與人腦膠質瘤的惡性程度負相關。膠質瘤發生時，miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表達受到抑制，且隨著膠質瘤惡性程度的加大，miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p受抑制程度加大。因此我們推斷miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p可能在膠質瘤的發生發展中起到一定作用。

參考文獻

1胡錦,王元元,董萬利,等. RNA干擾介導的膠質瘤細胞IGF-1R基因下調誘導腫瘤細胞凋亡. 中國神經精神疾病雜志,2006,32: 224-227.

2Nelson KM,Weiss GJ. MicroRNAs and cancer: past, present, and potential future. Molecular cancer therapeutics,2008,7: 3655-3660.

3O'Hara SP, Mott JL, Splinter PL, et al. MicroRNAs: key modulators of posttranscriptional gene expression. Gastroenterology,2009,136: 17-25.

4Croce CM. Causes，consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nature reviews. Genetics,2009,10: 704-714.

5Gao H, Zhao H,Xiang W. Expression level of human miR-34a correlates with glioma grade and prognosis. Journal of neuro-oncology,2013,113: 221-228.

6He L, He X, Lim LP, et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature,2007,447: 1130-1134.

7Ji Q, Hao X, Zhang M, et al. MicroRNA miR-34 inhibits human pancreatic cancer tumor-initiating cells. PloS one,2009,4: e6816.

8Landgraf P,Rusu M,Sheridan R, et al. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell,2007,129: 1401-1414.

9Xi Y, Nakajima G, Gavin E, et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA,2007,13: 1668-1674.

10Li J, Smyth P, Flavin R, et al. Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells. BMC Biotechnol,2007,7: 36.