COX-2mRNA在骨關節炎性病變過程中的作用研究

論著

COX-2mRNA在骨關節炎性病變過程中的作用研究

李冠甘麗嬌鐘妙容

作者單位： 516002廣東省惠州市第三人民醫院風濕免疫科

【摘要】目的探討環氧化酶-2基因(COX-2 mRNA)在骨關節炎性病變中的變化及其作用。方法以風濕免疫科2010至2014年收治的51例膝骨性關節炎患者(病例組)及20例非膝骨性關節炎患者(對照組)為研究對象，根據膝骨性關節炎的病變進程分為早期組(17例)、中期組(19例)和晚期組(15例)，分別采用實時熒光定量法(RT-PCR)檢測各組患者的成纖維樣滑膜細胞中COX-2mRNA表達水平、采用Western-blot法檢測各組COX蛋白表達水平。結果病例組患者成纖維細滑膜樣細胞中COX-2mRNA及蛋白表達灰度值分別為0.76±0.11、0.85±0.09均顯著高于對照組(P<0.05)。早期組、中期組、晚期組患者和對照組成纖維細滑膜樣細胞中COX-2mRNA及蛋白表達灰度值差異有統計學意義(P<0.05)；早期組COX-2mRNA及蛋白表達灰度值分別為0.92±0.09、0.98±0.09，均顯著高于中期組、晚期組患者和對照組(P<0.05)；中期組、晚期組患者COX-2mRNA及蛋白表達灰度值差異無統計學意義(P>0.05)；中期組、晚期組患者COX-2mRNA及蛋白表達灰度值顯著高于對照組(P<0.05)。結論膝骨性關節炎患者成纖維細滑膜樣細胞中COX-2mRNA及蛋白表達水平顯著高于非股性關節炎患者，同時表達水平早期最高，說明環氧化酶-2基因可能主要作用于膝骨性關節炎患者炎癥病變的早期。

【關鍵詞】環氧化酶-2基因；骨關節炎；病變；作用

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.20.007

【中圖分類號】R 684

收稿日期：(2015-02-02)

Study on the role of COX-2mRNA in the process of inflammatory lesion of bone and jointLIGuan,GANLijiao,ZHONGMiaorong.DepartmentofRheumatology,TheThirdPeople’sHospitalofHuizhouCity,Guangdong,Huizhou516002,China

Abstract【】ObjectiveTo observe the changes of cyclooxygenase-2 gene (COX-2 mRNA) in the process of inflammatory lesion of bone and joint,and to explore its effects on the lesions.MethodsFifty-one patients with knee osteoarthritis (case group) and 20 patients with non knee osteoarthritis (control group) who were admitted into Department of Rheumatism Immunization Diseases of our hospital from 2010 to 2014 were enrolled in the study. According to the process of inflammatory lesion of bone and joint,these patients were redivided into early period group (n=17),middle period group (n=19) and late period group (n=15).The expression levels of COX-2mRNA in fibroblast like synovial cells were detected by Real-time fluorescence quantitative PCR (RT-PCR),and the expression levels of COX protein were detected by Western Blot.ResultsThe expression gray values of COX-2mRNA and protein in fibroblast like synovial cells in case group were 0.76±0.11,0.85±0.09,respectively, both of them were significantly higher than those in control group (P<0.05). There were significant differences in the expression gray values of COX-2mRNA and protein among early period group,middle period group,late period group (P<0.05). The expression gray values of COX-2mRNA and protein in early period group were 0.92±0.09,0.98±0.09,respectively, both of them were significantly higher than those in middle period group,late period group and control group (P<0.05),however, there were no significant differences in the expression gray values of COX-2mRNA and protein between middle period group and late period group (P>0.05). The expression gray values of COX-2mRNA and protein in middle period group and late period group were significantly higher than those of control group(P<0.05).ConclusionThe expression gray values of COX-2mRNA and protein in fibroblast like synovial cells in patients with knee osteoarthritis are significantly higher than those of patients with non knee osteoarthritis,moreover, the expression levels are the highest at early period,which suggests that cyclooxygenase-2 gene may play an important role in early period of inflammatory lesions of bone and joint in patients with knee osteoarthritis.

【Key words】cyclooxygenase-2 gene; osteoarthritis; lesions; role

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種以關節軟骨進行性損害的慢性退行性病變[1]，可由高齡、肥胖、關節長時間過度勞損、創傷等因素引起關節軟骨發生破損，而關節周邊和軟骨下骨代償性增生。金屬基質蛋白酶(MMPs)和多種炎性因子在OA病變過程中起到重要作用，前者在OA的慢性降解中發揮重要作用，后者對關節炎性病變的發展具有重要影響。環氧合酶-2(COX-2)在前列腺素合成過程中發揮重要作用，其控制著合成反應的速度及產物的合成量，間接調控者前列腺素的生物學效應，調節血管的生成和炎性因子的釋放，促進OA的進展[2]。本文通過分析COX-2在不同分期骨關節炎患者中的含量，以探討其在OA中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料以本院風濕免疫科2010至2014年收治的51例膝骨性關節炎患者(病例組)及20例非膝骨性關節炎患者(對照組)為研究對象。病例組51例，男14例，女37例；年齡37～76歲，平均年齡(58.1±11.2)歲；對照組20例，男5例，女15例；年齡35～70歲，平均年齡(54.3±12.8)歲。

1.2納入標準所有患者的診斷均符合2007年中華醫學會骨關節分會制定的膝骨性關節炎的診斷標準[4]；X線Kellgren-Lawrence分級為Ⅰ～Ⅳ級；均在本院接受相關檢查及治療；對照組患者來自于單純半月板損傷、前交叉韌帶損傷及單純外傷患者。

1.3排除標準合并嚴重的心、肺、腎、腦等部位的嚴重疾病或精神性疾病的患者；合并其他類型的風濕性疾病患者；近2個月采用激素治療的患者；孕期或哺乳期女性。

1.4分組方法比較病例組和對照組的成纖維樣滑膜細胞中COX-2mRNA、蛋白表達水平。并根據X線Kellgren-Lawrence分級標準將病例組患者分為早期組(17例，Ⅰ～Ⅱ級)、中期組(19例，Ⅲ級)和晚期組(15例，Ⅳ級)與對照組進行比較。

1.5RT-PCR方法關節鏡手術取出的滑膜組織，無菌條件下剪碎、碾磨，用Trazol溶液提取對照組和病例組滑膜組織中的總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。設計COX-2mRNA引物，上游序列為：5’-GGTCTGGTGCCTGGTCTGATGATG-3’；下游序列為：5’-GTCCTTTCAAGGAGAATGGTGC-3’。內參基因序列為β-actin：上游序列為：5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，下游序列為：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。取對照組和病例組各1.5 μl的cDNA作為模版，分別加入1 μl dNTP，2.5 μl 10×buffer，經過高溫變性、退火后進行PCR儀檢測。

1.6Western-blot法取對照組和病例組的軟骨組織，經過細胞裂解液、超聲破碎儀處理后，離心，收集上清，然后進行SDS-PAGE凝膠電泳。獲得蛋白質轉移至硝酸纖維素膜(NC)上，25℃封閉60 min，然后加入COX-2蛋白抗體，37℃孵育2 h，多次漂洗后加入二抗，25℃孵育2 h，多次漂洗后，數碼攝像。

2結果

2.1病例組和對照組的成纖維細滑膜樣細胞中COX-2mRNA及蛋白表達情況病例組患者成纖維細滑膜樣細胞中COX-2mRNA及蛋白表達灰度值分別為0.76±0.11、0.85±0.09，均顯著高于對照組(P<0.05)。見表1，圖1。

表1　2組患者成纖維細滑膜樣細胞中COX-2mRNA及

圖1病例組和對照組成纖維細滑膜樣細胞中COX-2mRNA及

蛋白表達情況

2.2不同膝骨性關節炎病變程度患者成纖維細滑膜樣細胞中COX-2mRNA及蛋白表達情況早期組、中期組、晚期組患者和對照組成纖維細滑膜樣細胞中COX-2mRNA及蛋白表達灰度值差異有統計學意義(P<0.05)；早期組COX-2mRNA及蛋白表達灰度值分別為0.92±0.09、0.98±0.09，均顯著高于中期組、晚期組和對照組(P<0.05)；中期組、晚期組COX-2mRNA及蛋白表達灰度值差異無統計學意義(P>0.05)；中期組、晚期組患者COX-2mRNA及蛋白表達灰度值顯著高于對照組(P<0.05)。見表2，圖2。

表2　不同膝骨性關節炎病變程度患者COX-2mRNA及蛋白表灰度值　 ±s

注：與對照組比較,*P<0.05;與早期組比較,#P<0.05

3討論

骨關節炎根據有無局部和全身致病因素可分為原發性骨關節炎和繼發性骨關節炎[3]，到目前為止前者的致病因素仍不確切，可能與老齡、女性、肥胖及關節長時間過度勞累有關；后者可因關節炎癥、代謝和內分泌異常導致[4]。骨關節炎患者主要表現為關節疼痛，尤其是清晨起床后關節疼痛明顯，適度活動后疼痛減輕，但若過度活動會使疼痛加重。病變關節主要的癥狀為腫脹、壓痛、關節活動時有響聲，嚴重者可有關節畸形。臨床上常進行血沉、血常規、X線、CT及MRI等檢查。結合患者病史和X線表現診斷該病并不困難，必要時可進行關節液檢查。目前，骨關節炎尚無特效藥，臨床治療的主要目的是減輕關節的負重，延緩病情進展，緩解患者癥狀。非甾體消炎藥和鎮痛藥常用于急性期患者緩解癥狀，關節置換術是晚期患者主要的治療措施，是矯正畸形、消除癥狀的最佳方法[5]，可明顯提高患者的生活質量。

圖2　不同膝骨性關節炎病變程度患者COX-2mRNA及蛋白表灰度值

OA主要的病理改變是軟骨組織的進行性退變，實質上是軟骨細胞的合成和凋亡平衡紊亂，軟骨細胞分泌的一些細胞因子增多，造成細胞外基質成分的不斷流失和軟骨細胞結構和功能的改變[6]。

COX是前列腺素合成的必要蛋白酶，而前列腺素在機體的多種機能活動中發揮重要作用。人體內的COX主要有兩種同工酶，COX-1和COX-2[7]。COX-1參與機體的生理活動，如胃黏膜的保護和調節血小板聚集等，后者則在炎癥和腫瘤的發病過程中發揮作用。正常情況下，人體內不含有COX-2，只有在炎癥或腫瘤等病理刺激下體內才可檢測到COX-2。骨關節炎病理表現為滑膜炎，軟骨細胞分泌的IL-1和腫瘤壞死因子(TNF-α)可促進滑膜炎癥的進展和軟骨結構的損害。IL-1作用于軟骨細胞和滑膜細胞，激活G蛋白偶聯系統和絡氨酸酶激酶系統[8]，使轉錄調節因子的活性增加，促進COX-2mRNA的合成和轉錄。COX-2可使關節中PGF2含量明顯增加，使軟骨基質中的蛋白多糖和Ⅱ型膠原發生分解代謝[9]，并抑制它們的合成代謝，使軟骨破壞與合成平衡失調，破壞大于合成。關節液中TNF-α濃度的增加，可促使COX-2濃度增加，進而促使COX-2發揮其生物學效應。TNF-α還可直接抑制Ⅱ型膠原和連接蛋白的基因表達過程[10]，使軟骨基質無法合成。

據報道，采用COX-2選擇抑制劑治療OA患者，可明顯減輕患者關節軟骨的損害[11]。本文病例組患者成纖維細滑膜樣細胞中COX-2mRNA及蛋白表達明顯高于對照組，說明OA患者受累關節內COX-2基因處于高表達，為臨床選擇COX-2選擇性抑制劑藥物治療提供理論依據。本文還發現早期組COX-2mRNA及蛋白表達高于中期組、晚期組患者，都高于對照組患者，但中期組、晚期組患者COX-2mRNA及蛋白表達相當，說明COX-2基因在疾病早期表達最高，該時期選擇COX-2選擇性抑制劑治療，其療效可能更佳，但本文樣本量較小，且目前尚無相關文獻證實[12]，故其說服力稍顯不足。因此，后續研究針對不同分期OA患者受累關節內的COX-2基因的表達及作用機制的研究十分必要。

綜上所述，膝骨性關節炎患者的成纖維細滑膜樣細胞中COX-2mRNA及蛋白表達水平顯著高于非骨性關節炎患者，且在病變早期表達量最高，說明COX-2在OA病變軟骨組織的損害過程中占據重要地位，抑制COX-2基因的表達可有效緩解關節軟骨的破壞。

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