環磷腺苷葡胺對骨髓間充質干細胞向心肌細胞分化的誘導作用及其機制探討

·論著·

環磷腺苷葡胺對骨髓間充質干細胞向心肌細胞分化的誘導作用及其機制探討

李丹1，張金國1，尉希清1，劉巖松2

(1濟寧醫學院附屬醫院，山東濟寧272029；2山東省腫瘤醫院)

摘要：目的探討環磷腺苷葡胺(MCA)誘導骨髓間充質干細胞(BMSCs)向心肌細胞分化的機制。方法體外培養BMSCs，將第3代BMSCs接種于96孔板中，分為對照組、MCA組、MCA+LY294002組。MCA組加入1×10-3 mmol/L的MCA，MCA+LY294002組加PI3K/AKT信號通路特異性抑制劑LY294002預處理30 min后，再加入1×10-3 mmol/L的MCA，兩組均誘導3 d后換為普通培養基繼續培養。對照組不做任何處理。培養4周后，采用熒光定量PCR法檢測心肌特異性基因GATA結合蛋白4(GATA-4)、縫隙連接蛋白43(CX43) mRNA，采用Western blot法檢測PI3K/AKT通路相關蛋白PI3K、磷酸化AKT(p-AKT)、磷酸化叉形頭轉錄因子的O亞型(p-Foxo3a)、DOK家族蛋白(DOK5)]的表達。結果MCA組、MCA+LY294002組GATA-4、CX43 mRNA表達均高于對照組(P均<0.01)，MCA+LY294002組GATA-4、CX43 mRNA表達均低于MCA組(P均<0.01)。MCA組PI3K、p-AKT、p-Foxo3a、DOK5表達均高于對照組及MCA+LY294002組(P均<0.01)。結論MCA可誘導BMSCs分化為心肌細胞，其機制可能與激活PI3K/AKT信號通路有關。

關鍵詞：環磷腺苷葡胺；骨髓間充質干細胞；心肌細胞；細胞分化

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.42.001

中圖分類號：R329.2文獻標志碼：A

基金項目：山東省醫藥衛生科技發展計劃項目(2013WSB34007)。

作者簡介：第一李丹(1986-)，女，在讀研究生，主要研究方向為心血管疾病。E-mail： 527843619@qq.com

作者簡介：通信張金國(1963-)，男，主任醫師，主要研究方向為心血管疾病 。E-mail： cck112000@aliyun.com

收稿日期：(2015-07-20)

Induction of meglumine adenosine cyclophosphate on bone marrow mesenchymal

stem cells differentiating into cardiomyocytes and the mechanism

LIDan1, ZHANG Jin-guo, WEI Xi-qing, LIU Yan-song

(1AffiliatedHospitalofJiningMedicalUniversity,Jining272029,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the mechanism of meglumine adenosine cyclophosphate (MCA) inducing the bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) differentiating into cardiomyocytes. MethodsBMSCs were cultured in vitro, and the third generation of BMSCs were inoculated into 96 hole boards, which were then divided into the control group, MCA group and MCA + LY294002 group. The MCA group was added with 1×10-3 mmol/L MCA , the MCA + LY294002 group was added with PI3K/AKT signaling pathway specific inhibitor 30 min pretreated with LY294002, and then was added with 1×10-3 mmol/L MCA. After induction for 3 days, the conventional culture medium was used in the two groups to continue the culture. The control group was not treated. After 4 weeks, the mRNA expression of myocardial specific GATA gene binding protein 4 (GATA-4) and gap junction protein 43 (Cx43) was detected by fluorescence quantitative PCR. The expression of PI3K/AKT pathway related proteins in each group, including phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), serine/threonine protein kinase (Akt), a forked head transcription factor O subtype (p-Foxo3a) and the DOK family proteins (DOK5), was detected by Western blotting. ResultsThe expression of GATA-4 and CX43 mRNA in the MCA group and MCA + LY294002 group was higher than that of the control group (all P<0.01), the expression of GATA-4 and CX43 mRNA in the MCA + LY294002 group was lower than that in the MCA group (all P<0.01). The expression of PI3K, p-AKT, p-Foxo3a and DOK5 in the MCA group was higher than that in the control group and MCA + LY294002 group (all P<0.01). ConclusionMCA can induce BMSCs differentiating into cardiomyocytes, and its mechanism may be related to the activation of PI3K/AKT signaling pathway.

Key words: meglumine adenosine cyclophosphate; bone marrow mesenchymal stem cells; myocardial cells; cell differentiation

骨髓間充質干細胞(BMSCs)具有多向分化潛能，在特定的誘導條件下可以分化為骨、軟骨、神經、心肌等細胞[1～4]，成為誘導分化的理想細胞。研究證實，BMSCs誘導分化后的細胞可用于治療慢性缺血性心力衰竭，改善患者的生存收益，提示BMSCs具有向心肌細胞分化的潛能[5]。環磷腺苷葡胺(MCA)可誘導BMSCs向心肌細胞分化[6,7]。但MCA誘導BMSCs向心肌細胞分化的機制尚不明確。磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)是與細胞增殖、分化有關的細胞內經典信號通路。2015年1～6月，我們應用MCA誘導BMSCs分化為心肌細胞，檢測心肌細胞PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達，探討MCA誘導BMSCs分化為心肌細胞的機制。

1材料與方法

1.1動物及試劑清潔健康SD大鼠1只，體質量80 g左右，雌雄不限，由濟寧魯抗生物技術有限公司提供。DMEM/F12培養基(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)，PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒(TaKaRa公司)，單克隆兔抗大鼠磷酸化AKT/蘇氨酸蛋白(p-AKT)抗體、磷酸化叉形轉錄因子的O亞型(p-Foxo3a)抗體(CST公司)，單克隆兔抗大鼠DOK家庭蛋白(DOK5)抗體(Abcom公司)

1.2BMSCs提取、培養將1只大鼠脫臼處死，取雙側股骨及脛骨，采用周榮等[7]報道的方法，通過全骨髓貼壁培養法建立BMSCs體外培養體系。

1.3細胞分組及干預將第3代BMSCs細胞接種于96孔板中，分為對照組、MCA組、MCA+LY294002組。MCA組加入1×10-3mmol/L的MCA，誘導3 d后換為普通培養基繼續培養。MCA+LY294002組加入PI3K/AKT信號通路特異性抑制劑LY294002預處理30 min后，再加入1×10-3mmol/L的MCA，誘導3 d后換為普通培養基繼續培養。對照組不做任何處理。共培養4周。

1.4心肌特異基因表達檢測4周后，采用熒光定量PCR法檢測心肌特異基因GATA結合蛋白4(GATA-4)、縫隙連接蛋白43(CX43)mRNA的表達。提取細胞總RNA，配制相應的逆轉錄反應體系。采用2-ΔΔCT計算GATA-4、CX43 mRNA的相對表達量。

1.5PI3K/AKT通路相關蛋白表達檢測采用Western blot法檢測各組PI3K/AKT通路相關蛋白PI3K、p-AKT、p-Foxo3a、DOK5的表達。通過化學發光試劑ECL顯影凝膠系統成像，利用Image J軟件通過比較條帶灰度值的方法計算各蛋白的相對表達量。

2結果

2.1各組心肌特異基因表達比較MCA組、MCA+LY294002組GATA-4、CX43 mRNA表達均高于對照組(P均<0.01)，MCA+LY294002組GATA-4、CX43 mRNA表達均低于MCA組(P均<0.01)。詳見表1。

表1　各組心肌特異基因表達比較 ± s)

注：與對照組比較，*P<0.01；與MCA+LY294002組比較，#P<0.01。

2.2各組PI3K/AKT通路相關蛋白表達比較MCA組PI3K、p-AKT、p-Foxo3a、DOK5表達均高于MCA+LY294002組及對照組(P均<0.01)。詳見表2。

表2　各組PI3K/AKT通路相關蛋白表達比較

注：與MCA組比較，*P<0.01。

3討論

心臟疾病是嚴重危害患者健康的重大疾病，由于壞死后的心肌細胞不能再生，對患者的治療及預后均存在較大影響。研究發現，BMSCs可被誘導分化為心肌細胞，為心臟疾病的治療帶來了新的曙光[8]。MSCs移植治療可改善缺血性心肌病患者的左室收縮功能，且臨床主要不良事件發生較少[5]。目前可以通過化學藥物、細胞因子、模擬體內微環境等作用方式誘導干細胞向心肌細胞分化，其中化學藥物應用廣泛，如二甲基亞砜(DMSO)可誘導小鼠胚胎性癌細胞P19衍生的P19CL6細胞系分化為心肌細胞，5-氮胞苷可誘導大鼠BMSCs分化為心肌細胞[9～11]。而DMSO、5-氮胞苷等藥物雖可誘導干細胞分化為心肌細胞，但誘導率最高僅30%，而且對細胞的毒性較大，尚不能應用于體內研究[12]。MCA是環磷腺苷的衍生物，為非洋地黃類強心藥物，由環磷腺苷與葡甲胺結合而成，具有較強的脂溶性，易于透過脂溶性細胞膜進入心肌內發揮作用[13]。周榮等[7]研究發現，在采用1×10-3mmol/L的MCA誘導3 d的條件下，可以發揮最佳的誘導BMSCs向心肌細胞分化的效果。并且，MCA具有良好的生物相容性，細胞毒性較小，可以應用于人體疾病的治療。但目前對MCA誘導BMSCs向心肌細胞分化的機制尚不明確。

PI3K/AKT是參與細胞增殖、分化、凋亡等多種功能調節的經典信號通路，廣泛存在于細胞中。 DOK家族蛋白是一類接頭分子，作為多種蛋白酪氨酸激酶的底物，參與了不同的信號傳導通路，在心肌細胞的生長、增殖和分化中發揮重要作用。DOK5在神經系統、骨骼肌和心肌中高表達，提示在神經系統和肌肉系統的發育過程中具有重要作用。Wen等[14]研究發現，在用DMSO誘導P19CL6細胞向心肌細胞分化時，PI3K/AKT通路在分化早期階段被激活，使Foxo3a被AKT磷酸化，導致轉錄因子滯留在細胞質，失去了對與心肌中表達下游靶基因DOK5的轉錄調控作用，從而使DOK5表達上調，促進心肌細胞的分化和增殖。本研究發現，MCA組心肌特異蛋白GATA-4、CX43 mRNA及PI3K/AKT信號通路相關蛋白PI3K、p-AKT、p-Foxo3a、DOK5表達均高于對照組，提示MCA誘導BMSCs后細胞內心肌特異蛋白表達增高，MCA誘導BMSCs向心肌細胞分化成功，MCA可能通過激活PI3K/AKT信號通路相關蛋白，從而發揮促進BMSCs向心肌細胞分化的作用；MCA+LY294002組心肌特異蛋白GATA-4、CX43 mRNA及PI3K/AKT信號通路相關蛋白PI3K、p-AKT、p-Foxo3a、DOK5表達均低于MCA組，提示LY294002可能通過特異性抑制PI3K/AKT信號通路，抑制PI3K、p-AKT、p-Foxo3a、DOK5的表達，抑制了BMSCs向心肌細胞分化的過程，證實MCA誘導BMSCs向心肌細胞分化的作用可能與激活PI3K/AKT信號通路有關。

綜上所述，MCA可誘導BMSCs分化為心肌細胞，其機制可能與激活PI3K/AKT信號通路有關。

參考文獻：

[1] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy Position Statement [J].Cytotherapy, 2006,8(4):315-317.

[2] Dezawa M, Takahashi I, Esaki M, et al. Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells[J]. Eur J Neurosci, 2001,14(11):1771-1776.

[3] Pikir BS, Susilowati H, Hendrianto E, et al. Reversin increase the plasticity of bone marrow-derived mesenchymal stem cell for generation of cardiomyocyte in vitro [J]. Acta Med Indones,2012,44(1):23-27.

[4] Piryaei A, Soleimani M, Heidari MH, et al.Ultrastructural maturation of human bone marrow mesenchymal stem cells-derived cardiomyocytes under alternative induction of 5-azacytidine[J]. Cell Biol Int, 2015,39(5):519-530.

[5] 陳麗媛,符春暉. MSCs移植治療對缺血性心肌病患者左室收縮功能影響的Meta分析[J].山東醫藥,2015,55(14):56-58.

[6] Strauer BE, Yousef M, Schannwell CM. The acute and long-term effects of intracoronary stem cell transplantation in 191 patients with chronic heart failure:the STAR- heart study[J]. Eur J Heart Fail, 2010,12(7):721-729.

[7] 周榮，姚巍，李彥紅，等. 環磷酸腺苷葡甲胺誘導骨髓間充質干細胞向心肌細胞分化的實驗研究[J].中國病理生理雜志,2011,27(10):2040-2044.

[8] Zeng Z, Jiang Z, Wang CS, et al, Preoperative evaluation improves the outcome in heart transplant recipients with pulmonary hypertensionretrospective analysis of 106 cases[J]. Transplant Proc, 2010,42(9):3708-3710.

[9] Habara OA. Differentiation of beating cardiac muscle cells from a derivative of P19 embryonal carcinoma cells[J]. Cell Struct Funct, 1996,21(2):101-110.

[10] Makino S，Fukuda K，Miyoshi S，et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro[J]. J Clin Invest, 1999,103 (5):697-705.

[11] 冼紹祥,楊忠奇,秦佳佳,等.5-氮胞苷誘導大鼠骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞分化及黃芪甲苷的協同作用[J]. 中國組織工程研究,2012,3,16(10):1861-1865.

[12] Pikir BS, Susilowati H, Hendrianto E, et al. Reversin increase the plasticity of bone marrow-derived mesenchymal stem cell for generation of cardiomyocyte in vitro[J]. Acta Med Indones, 2012,44(1):23-27.

[13] 張雪芳,李軍,烏蘭.環磷腺苷葡胺注射液對急性心肌梗死患者左心功能的影響32例分析[J].中國醫藥導報,2009,6(14): 73-74.

[14] Wen J, Xia Q, Wang C, et al. Dolc-5 is involved in cardiomyocyte differentiation through PKB/FOX03a pathway[J]. Mol Cell Cardiol, 2009,47(6):761-769.