A102/B301亞型血型特點分析

A102/B301亞型血型特點分析

胡彬，潘海平，朱于莉，馮智慧

(青島市中心血站輸血研究所，山東青島266071)

摘要：目的報告1例A102/B301亞型血型，分析其血型特點。方法對1例無償獻血者的全血標本用血型血清學方法鑒定血型，對ABO基因第6、7外顯子核苷酸序列采用直接測序和克隆測序進一步鑒定亞型。結果該樣本血清學結果顯示為AB亞型。測序結果與標準序列A101對比顯示，該樣本第6、7外顯子297A/G、467C/T、526C/G、657C/T、703A/G、796A/C、803C/G、930A/G、1054C/T、1096A/G雜合，進一步針對第6、7外顯子克隆測序結果顯示該樣本為雜合序列，分別與標準序列A101對比顯示其中一條467為T，另外一條序列與B101序列比對發現，第1 054位堿基C>T導致第352位氨基酸由精氨酸變為色氨酸，確定為A102/B301亞型。結論 發現1例罕見的A102/B301亞型；對于正反定型不符的血清學表現血型，應進一步采用基因檢測以確定其血型亞型。

關鍵詞：ABO血型系統；AB亞型；基因型；測序

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.42.041

中圖分類號：R457.1 文獻標志碼：B

基金項目：山東省青島市市南區科技發展資金項目(2013-13-013-YY)。

收稿日期：(2015-05-20)

通信作者：馮智慧

ABO血型系統是最重要的血型系統。除標準的A、B、O和AB表型外，還可出現A1和A2亞型及其他罕見亞型。單堿基突變是大多數亞型產生的原因[1]。Salmon參照A變異型分類方法，將B亞型分為B3、Bx、Bm、Bel，不符合這4種類型的其他B亞型均歸為Bw[2]。目前,B3被認為是最稀少的一種B亞型，中國人群中大約900個B型個體中有1例是B3，1 800例A1B獻血者中有1例是A1B3[3]。2014年11月，我們鑒定出1例呈A102/B301亞型的無償獻血者血型，現報告如下。

1材料與方法

1.1材料1例健康男性無償獻血者的EDTA-Na2抗凝全血標本，獻血者年齡26歲，無輸血史及重大疾病史。

1.2試劑及儀器試劑：單克隆抗A、抗B、多克隆抗人球蛋白試劑、ABO細胞、抗體篩選細胞均為Sanquin公司試劑；抗H、抗A1、抗AB購自上海生物制品有限公司；人源抗A、抗B購自成都血研所；基因組DNA提取試劑盒購自Invirtrogen公司；Exon6、7測序引物(PAGE級)、Ex-Taq試劑盒、LA-Taq試劑盒和及高效克隆PCR產物專用載體(pMD18-T vector)由TaKaRa公司提供。儀器：Kubo7A 2420細胞洗滌離心機；Bio-Rad C1000 PCR擴增儀；美國AB公司3100-Avant型測序儀。

1.3血型血清學檢測EDTA-Na2抗凝外周靜脈血，采用試管法進行ABO正反定型，用篩選細胞對樣本血清進行抗體篩選，以明確或排除不規則抗體的存在。

1.4血型序列分析鹽析法提取血液標本全基因組DNA，操作步驟參照試劑盒說明書。對ABO基因第6和第7外顯子進行序列分析，引物設計參照Olsson[4]設計的兩對引物對Exon6和Exon7進行擴增，測序引物分別為：Exon Ⅵ正義鏈為5′-CGGAATTCACTCGCCACTGCCTGGGTCTC-3′，反義鏈為5′-CGGGATCCATGTGGGTGGCACCCTGCCA-3′；Exon Ⅶ正義鏈為5′-CGGGATCCCCGTCCGCCTGCCTTGCAG-3′，反義鏈為5′-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3′。將第6、7外顯子測序結果與標準序列A101對比。PCR擴增反應程序如下：95 ℃預變性10 min，94 ℃ 60 s、63 ℃ 90 s、72 ℃ 60 s共10個循環，94 ℃ 60 s、61 ℃ 90 s、72 ℃ 60 s共25個循環，72 ℃延伸10 min，10 ℃保溫。擴增產物切膠純化，正反雙向測序。使用LA-Taq酶特異性擴增ABO基因Exon6、Intron6和Exon7行單倍體序列分析，將PCR產物克隆入T載體，挑取多個陽性菌落進行測序鑒定，確定樣本的單倍型。

2結果

2.1血型血清學結果見表1。

2.2血型序列分析 ABO第6、7外顯子測序297A/G、467C/T、526C/G、657C/T、703A/G、796A/C、803C/G、930A/G、1054C/T、1096A/G雜合。ABO第6、7 外顯子單倍型測序示，其中一條單倍型為A102，另外一條單倍型序列與B101比對發現，在第1 054位堿基發生了C>T的突變，導致352位氨基酸由天冬氨酸轉變為色氨酸，確定基因型為A102/B301亞型。

表1　1例A 102/B 301亞型的血清學正反定型結果

注：抗-H與Bc反應2+，與Oc反應4+。

3討論

ABO血型系統是臨床輸血及移植相關的最重要的血型系統。除了常見的A1和A2亞型外，還存在其他罕見的ABO亞型，其他罕見的亞型通過A和B抗原的量以及在紅細胞上的分布進行分類[5]。基因改變是亞型發生的基礎，ABO基因堿基突變可致表達糖基轉移酶的氨基酸改變[6,7]，可能會導致抗原合成減少，從而在血清學實驗中表現為抗原與抗A或抗B的反應強度減弱[9,10]。研究表明，同一位置不同種類和性質的氨基酸置換可導致血清學表型的巨大差異，氨基酸極性發生改變，造成蛋白質構象改變，進而影響酶蛋白的催化活性和抗原表達，影響酶蛋白的三維結構[11,12]。進而導致ABO血型基因的產物A和(或)B血型糖基轉移酶活性改變，造成血清學改變，導致正反定型不符、凝集強度與凝集狀態改變或檢出不規則抗A或抗B[13]。

紅細胞血型血清學技術雖然相對較完善和標準化，但其只能鑒定表型，在對亞型、因疾病導致的血型改變、部分疑難標本的ABO分型和做遺傳學分析時受到局限[14]。基因分型技術可克服血型血清學方法的局限性，是鑒定ABO血型分析的重要手段[15]。本研究發現，采用血清學檢測后，該樣本血清學正反定型不符，正定B抗原減弱，反定檢出抗B抗體，依據血清學定為AB亞型；ABO第6、7外顯子測序結果顯示第1 054位堿基為C/T雜合，進一步克隆測序結果顯示其中一條序列為A102，另一條序列與B101比較，第1 054位堿基發生C>T的改變，該樣本的序列分析結果符合A102/B301亞型，考慮該堿基的改變導致第352位氨基酸由天冬氨酸變為色氨酸。大多數B3亞型血清學表現3+混合視野凝集現象，而本組該樣本用試管法多次離心后，混合視野凝集強度僅顯示弱陽性，推測原因,為該樣本的A抗原競爭性占據了紅細胞上的抗原表位,導致B抗原表達進一步減少。此外，我們在采用臨床經常使用的凝膠卡進行正反定型的過程中，發現正定型抗B結果顯示陰性，提示該樣本在臨床非常容易被錯定為A型,從而發生輸血錯誤。

參考文獻：

[1] Storry JR, Olsson ML. The ABO blood group system revisited:a review and update[J]. Immunohematology, 2009,25(2):48-59.

[2] 蘭炯采,張志欣.開展血型基因及其應用研究把輸血醫學推向分子水平[J].中國輸血雜志,2008,21(3):161.

[3] Lin CM, Broadberry RE, Chiou PW. The B3 phenotype in Chinese[J]. Transfusion, 1986,26(5):428-30.

[4] Olsson ML ,Chester MA.Polymorphisms at the ABO locus in subgroup A individuals[J]. Transfusion, 1996,36(4):309-313.

[5] 杰夫·丹尼爾. 人類血型[M].北京:科學出版社,2007:36-41.

[6] 王憬惺. 輸血技術[M].3版.北京:人民衛生出版社,2013:270-271.

[7] 王靜，韓麗，遲曉云,等. 1例ABO 血型正反定型不符患者血型分子生物學鑒定[J] .山東醫藥,2015, 55(19):51-53.

[8] Xiaohong C，Sha J，Xi L，et al. Molecular genetic analysis of ABO blood group variations reveals 29 novel ABO subgroup alleles[J]. Transfusion,2013,53(11):2910-2916.

[9] 趙桐茂.人類血型遺傳學[M].北京:科學出版社,1987:53-54.

[10] Yamamoto F, Marken J, Tsuji T, et al. Cloning and characterization of DNA complementary to human UDP-GalNac: fucal2GalNac transferse mRNA[J]. J Bio Chem,1990,256(2):1146-1151．

[11] 焦立新,于曉麗,門小菲,等.1例BX亞型的分子機制研究[J].臨床輸血與檢驗,2010,22(12):19-21.

[12] 粱延連,俞瓊,蘇宇清.B亞型中Bx新等位基因的鑒定[J].中國輸血雜志, 2006,19(1):21-24．

[13] 向東.ABO亞型的檢測[J].中國輸血雜志,2010,23(8):577-580．

[14] 張印則，蘭炯采.加強血型血清學培訓與研究，提高臨床輸血水平[J]. 中國輸血雜志，2007,20(1):3.

[15] 蘭炯采,孟慶寶,張印則,等.ABO血型基因分型及應用[J].中國免疫學雜志,2002,18(6):430-433.