應用多參數技術方法對腦缺血皮質區神經細胞凋亡的檢測

應用多參數技術方法對腦缺血皮質區神經細胞凋亡的檢測

張文麗朱瑩王瑞敏李倩郭靜劉國榮耿福

(河北聯合大學醫學實驗研究中心， 唐山 063000)

摘要：隨著生物科學研究技術的不斷提高和對細胞凋亡認識的不斷深入，在細胞凋亡確認過程中，若單獨使用一種方法檢測會出現一定概率的假陽性，往往需要采用多參數技術方法相互印證。本實驗結合透射電鏡、流式細胞儀和共聚焦顯微鏡的檢測技術及原理，通過多技術相結合觀察判斷了急性腦缺血皮質神經元細胞凋亡,并進行了定性、定量分析。

關鍵詞：腦缺血；皮質細胞；凋亡檢測

作者簡介：張文麗，女，1974年出生，高級實驗師，研究方向：腦缺血及腦損傷機制，E-mail：dianj@163.com。

DOI:10.3936/j.issn.1001-232x.2015.01.014

收稿日期：2014-07-19

Detection of nerve cell apoptosis in ischemic cortex by multi-parameter technology.ZhangWenli，ZhuYing，WangRuimin，LiQian，GuoJing，LiuGuorong，GengFu(MedicalLaboratoryResearchCenter,HebeiUnitedUniversity,Tangshan063000,China)

Abstract:This article decided the acute ischemic cortex neurons apoptosis which combined the detection technology and principles of transmission electron microscope, flow cytometry and laser scanning confocal microscope. And conducted the qualitative and quantitative analysis.

Key words：cerbral ischemic; cortial cells; detection of apoptosis

1前言

腦缺血性疾病是人類常見病、多發病，有關研究較多。但迄今為止其機理仍未完全清楚。急性腦缺血在臨床上是最常見的腦卒中類型，占全部腦卒中的60%～80%。近年來大量研究表明[1-3]，急性腦缺血通過各種原因引起腦血液循環灌注不足，腦組織發生病理性的改變。神經細胞的凋亡是腦缺血后神經元死亡的重要方式。正常腦發育過程中有30～70%的神經元是通過凋亡來清除老化細胞，細胞凋亡不僅在正常發育的神經元中發生，也在許多神經系統疾病中發生并起重要作用，如腦梗塞、腦外傷、脊髓損傷等。因此研究神經細胞的凋亡在神經科學中已成為了一個非常活躍的領域。細胞凋亡發生的原因和途徑是復雜多樣的，腦缺血損傷誘導神經元凋亡途徑包括線粒體途徑，單胺類神經遞質受體途徑，神經細胞內Ca2+超載和內質網應激途徑等[4-6]。

細胞凋亡是有核細胞在一定條件下啟動的其自身內部機制, 主要通過內源性 DNA內切酶的激活而發生的自然死亡過程,受基因調控,需新的蛋白質合成。細胞凋亡對細胞增殖、組織的發生和機體的功能維持起著重要作用。但在病理條件下，機體可誘發細胞凋亡發生。在形態學上凋亡截然不同于細胞壞死，凋亡可通過形態學觀察、DNA片斷化分析及凋亡相關分子蛋白檢測等確定。但對凋亡形態認定結合細胞的定量分析也是檢測細胞凋亡最直接可靠的方法。

2材料和方法

2.1　模型建立與動物分組

SPF級雄性SD大鼠20只，體重280～350g，由北京市華阜康生物科技股份有限公司提供。在我校動物飼養中心標準化喂養。通過兩血管法即雙側頸總動脈結扎建立腦缺血模型[7，8]；首先用10%水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉，頸部消毒后正中切口，鈍性分離出雙側迷走神經與頸總動脈，用4號絲線雙重結扎剪斷頸總動脈，縫合切口時注入慶大霉素4萬單位預防感染。大鼠隨機分為四組，對照組、腦缺血后6h、24h、72h組；對照組不致傷，本實驗符合動物倫理學標準。

2.2　透射電鏡取材及樣品制備

各組大鼠麻醉后斷頭，均切取左側腦皮質組織，1mm×1mm×2mm大小，放入2.5%戊二醛液中固定3h，再用1%鋨酸后固定1h，乙醇梯度脫水，環氧樹脂815包埋，超薄切片75nm ，醋酸鈾染色15min，檸檬酸鉛染色10min，日本Hitachi公司H-7650型透射電鏡觀察分析，美國Gatan公司CCD相機拍照。

2.3　流式細胞儀測定

將剩余左側腦皮質組織切碎后置于4℃70%乙醇中保存。研磨腦組織，生理鹽水沖洗, 制備成組織懸液，將組織懸液收集后離心5min,棄上清,向沉淀物中加入0.5%胃蛋白酶2mL，37℃消化30min,加入生理鹽水稀釋到5mL再次過濾，將濾液離心3min，棄上清。向沉淀物中加入細胞核熒光素溴化乙啶(EB，10μg/mL)，染色30min, 美國BD公司Facscdidur流式細胞儀分析。每個樣品分析1×106/mL細胞,計算細胞凋亡率。

2.4　激光共聚焦顯微鏡樣品制備

取同一只大鼠的右側腦皮質組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片，撈片于多聚賴氨酸防脫載玻片上，常規脫蠟、脫水，用蛋白酶K室溫孵育30min，PBS沖洗樣品，滴加50ulTUNEL反應液進行標記，37℃濕盒內孵育1h，PBS沖洗樣品,日本Olympus公司FV1000型共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

2.5　統計學處理

3結果

3.1　透射電鏡超微結構觀察

對照組大鼠腦皮質神經元細胞核膜清晰完整，核大而圓，核內異染色質及常染色質分布正常，胞質有大量粗面內質網及豐富的游離核糖體;線粒體結構完整。軸索結構正常。6h組神經元細胞核不規則，核膜凹陷，核內異染色質及常染色質分布基本正常，線粒體部分空化變性。24h組皮質神經元細胞皺縮，核內染色質分布不均勻，異染色質邊集，細胞呈凋亡早期改變，胞漿內線粒體腫脹、空化；內質網擴張、有脫顆粒現象，核糖體減少。軸索結構排列紊亂、腫脹。48h組神經元細胞核內異染色質邊集、核固縮，呈典型凋亡樣改變。細胞器少，內質網擴張，線粒體腫脹、空化。鏡下較6h、24h組有明顯核固縮及凋亡細胞征象，也多見死亡細胞。72h組神經元細胞核內染色質分布不均勻，異染色質邊集，有部分線粒體腫脹、空化；內質網擴張；細胞呈凋亡樣改變(圖1)。

圖1　透射電鏡下超微結構(1500x) A正常組，B 6h組, C 24h組, D 48h組, E72h組, 箭頭示神經元細胞核

3.2　大鼠腦皮質細胞凋亡發生率的影響

流式細胞術通過熒光染料與細胞的特異性結合,有一定的量效關系。在腦缺血6h、24h、48h、72h組與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；提示腦缺血后早期皮質區細胞凋亡率隨缺血時間的延長而增加，6h組細胞凋亡率較低，48h組細胞凋亡率最高，與24h、48h組相比，72h組細胞凋亡率有所降低(圖2)。

圖2　缺血后各時間點腦皮質凋亡細胞率 注： #與對照組相比p<0.05

3.3　激光共聚焦顯微鏡腦皮質掃描結果

激光共聚焦顯微鏡下一些細胞熒光顏色的改變與神經細胞凋亡有關。本實驗中TUNEL(綠色熒光)陽性染色代表凋亡樣損傷的神經元。對照組神經元排列整齊緊密，凋亡的神經元數量極少，6h組可見生存的神經元數量較少，而凋亡樣損傷的神經元數量增多(p<0.05)，24h、48h組可見大量凋亡樣神經元，存活的神經元數量明顯減少(p<0.05)，72h組仍可見大量凋亡樣損傷神經元，但較24h、48h組有所減少(p<0.05)(圖3、圖4)。

圖3　激光共聚焦顯微鏡腦皮質凋亡細胞

圖4　缺血后各時間點腦皮質細胞凋亡數量

4討論

國內外大量研究發現大多數腦梗死和老年癡呆癥的發病前期都曾有腦缺血的存在[9]。本實驗通過手術，進行永久性結扎大鼠雙側頸總動脈，制備急性腦缺血動物模型，這種方法實質上是由于大腦特定部位的血流供應受阻所導致的血氧不足或腦缺氧，不能滿足腦部能量的供給，最終導致神經細胞的功能下降。較好地模擬了臨床急性腦梗塞或缺血性中風疾病。腦缺血后，神經元損傷具有選擇性和易損性的特點。細胞凋亡的形態學檢測結果直觀, 至今仍是判定細胞是否發生凋亡的金標準。電鏡下一些細胞核染色質的改變與神經細胞凋亡有關。缺血6h組神經元細胞核不規則，核膜凹陷，線粒體略有腫脹。24h及48h組凋亡形態細胞較多，細胞核內染色體凝縮并沿核膜形成團塊,細胞質開始濃縮,內質網解體,線粒體腫脹,但沒看見凋亡小體出現。72h組有細胞皺縮，細胞器有腫脹、空化、核染色質不均勻等凋亡現象。

流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡對細胞的定量、細胞熒光定位分析是不可或缺的檢測技術，可以彌補電鏡形態檢測的局限性。流式細胞儀對檢測的細胞經過熒光染色后，通過激光檢測區時受激光激發，發出特定波長的熒光通過濾色片，可將不同波長的散射光、熒光信號區分開來，并傳送到不同的光電倍增管中，經過信號轉換、放大，數字化處理對細胞進行定量及其分選的分析。激光共聚焦顯微鏡可進行細胞形態定位、定量熒光測定、定量圖像分析等實用研究[10]。可以獲得普通光鏡無法達到的分辨率。本研究的結果表明急性腦缺血造成大鼠皮層腦組織發生細胞凋亡,凋亡的細胞數量隨缺血時間的不同具有一定的時相性, 6h組可見少量凋亡的神經細胞,24h繼續增加,48h凋亡的神經細胞較多，達到高峰,72h有所減少。流式細胞儀檢測與激光共聚焦檢測結果相一致。主要可能由于腦缺血缺氧致使線粒體的氧化磷酸化作用受到影響，細胞合成或分泌蛋白質的過程受阻，神經遞質、第二信使、酶類、受體減少，能量供應不足，DNA的轉錄復制功能降低；導致神經元代謝功能紊亂；呈現一種遲發性神經元凋亡現象。

總之，細胞凋亡的檢測方法很多，都是基于細胞凋亡過程中的各種特征進行設計的，不同的實驗條件，檢測得到細胞凋亡的結果也不一樣，到目前，每種檢測方法都有它一定的局限性。在進行實驗時, 要采用并綜合多參數技術方法進行檢測相互論證，才能捕捉到有利的、明顯的細胞凋亡證據。

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