產油霉菌油脂提取方法的研究

謝瑩 霍秋娟 吳彥雙 張震 劉爽 吳辰宇

摘要：以產油霉菌雅致小克銀漢霉為例進行了前處理及油脂提取方法的研究，采用了酸熱法、反復凍融法以及超聲波和酶結合法破碎細胞，甲醇-氯仿提取油脂以及乙醚、石油醚索氏抽提法直接提取油脂。結果表明，超聲波和酶結合使用破碎細胞，甲醇-氯仿提取油脂的效果較好；索式抽提法采用石油醚為提取劑效果較好。氣相色譜-質譜聯用儀分析檢測油脂脂肪酸組成為棕櫚酸25.10%，油酸25.17%，亞油酸20.99%，硬脂酸4.78%。

關鍵詞：產油霉菌 細胞破碎 提取 油脂得率

中圖分類號： Q819 文獻標識碼：A 文章編號1672-3791（2015）08（b）-0000-00

開發利用微生物進行油脂的生產已經成為當今的一大熱點，不但可以作為動植物油脂的必要補充，在促進人類保健方面起著越來越重要的作用，還可以作為生產生物柴油的油源，對解決當今世界各國油脂原料供應問題、促進生物柴油的推廣使用、解決環境問題和人類能源問題等都具有重要的意義[1-2]。由于不同種類的微生物細胞壁的結構不同，如霉菌有堅韌 的細胞壁，使我們不能直接獲得油脂或者只能獲得少量油脂，因此，提取前用前處理方法破壞菌體細胞就顯得非常必要[3]。本研究主要以產油霉菌雅致小克銀漢霉為例進行了前處理及油脂提取方法的研究，為今后大規模生產微生物油脂奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

雅致小克銀漢霉菌株：中國工業菌種保藏中心購買。

1.2培養基及主要試劑

（1）PDA固體培養基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂16 g，蒸餾水1000mL，115 ℃滅菌20 min。

（2）限氮培養基：葡萄糖40 g/L，（NH4）2SO4 1.5 g/L，KNO3 0.5 g，KH2PO4 7 g/L，NaH2PO4 2 g/L，蒸餾水1000 mL，115 ℃滅菌20 min。

（3）各種試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 雅致小克銀漢霉菌株的培養

將PDA固體培養基斜面低溫保存的雅致小克銀漢霉菌株接入到限氮培養基中，于28 ℃，180 r/min的恒溫搖床上培養5 d；離心收集菌體，用于油脂提取研究。

1.3.2 油脂提取方法

采用酸熱法[4]、反復凍融法[5]以及超聲波和酶結合法[6]破碎細胞，甲醇-氯仿提取油脂[7]以及乙醚、石油醚索氏抽提法[8]直接提取油脂。

1.3.3油脂脂肪酸成分分析

稱取油脂0.5 g，加1%硫酸-甲醇20 mL與70 ℃水浴加熱30 min，加入20 mL正己烷提取甲酯化產物，取出上清，再用10 mL正己烷清洗一次，合并上清，放入瓶中。用GC-MS-2010-plus氣相色譜-質譜聯用儀檢測油脂成分。

2 結果與討論

2.1 酸熱法提取油脂的研究

用不同濃度的鹽酸溶液對菌株進行細胞破碎，用甲醇-氯仿溶液萃取，計算油脂得率，結果如圖1所示。

圖1 鹽酸濃度對油脂得率的影響

結果表明，油脂得率與鹽酸濃度有關，在一定的濃度范圍內，得率隨濃度的增加而增加，超過這個范圍后，得率隨濃度的增加而減小，可能由于鹽酸濃度過高，會水解油脂，使收率降低。

2.2 反復凍融法提取油脂的研究

使用凍融法對菌株進行破碎，甲醇-氯仿提取油脂。考察不同凍融次數對油脂提取的影響，結果如圖2所示。

圖2 凍融次數對油脂得率的影響

隨著凍融次數的增加，油脂得率增加，但增加的不明顯。此方法破碎細胞，提取的油脂量較低。反復凍融法是通過溫度的突然變化，在細胞內形成冰粒， 發生溶脹破碎，由于耗時較長，部分細胞產生了自溶使油脂含量減少。

2.3 超聲波與酶結合法提取油脂的研究

先用纖維素酶處理菌體細胞壁，然后改變超聲次數破碎菌體，用甲醇-氯仿提取油脂，結果如圖3所示。

圖3 超聲次數對油脂得率的影響

該法采用了酶法和機械法相結合，酶作用后大部分細胞壁裂解，再利用超聲波產生獨特的機械振動作用使細胞結構發生變化，促使細胞破。結果表明，破碎后測得的油脂含量隨超聲次數的增加而增大，當達到一定次數時，油脂得率趨于穩定，此方法提取的油脂量與其它方法相比最高，油脂得率達24%。

2.4 索式抽提法

分別以乙醚和石油醚為溶劑，在相同條件下用索式抽提法提取油脂，測得的油脂得率分別為12%和14.8%，表明石油醚的抽提效果較乙醚好。選擇石油醚為提取劑，測定不同時間的油脂得率，結果如圖4所示。

圖4 抽提時間對油脂得率的影響

上圖表明抽提時間越長，油脂得率越高，在抽提9 h到10 h時，油脂得率升高明顯。

2.5 油脂脂肪酸成分分析

使用GC-MS-2010-plus氣相色譜-質譜聯用儀檢測油脂成分，結果如表1所示。經過分析測定該菌株油脂的成分主要是棕櫚酸、油酸、亞油酸、硬脂酸，與植物脂肪酸的成分相似，可作為生物柴油的原料。

表1 菌株的脂肪酸組成

名稱

分子量

脂肪酸組成%

油酸甲酯

296

26.23

棕櫚酸甲酯

270

25.45

亞油酸甲酯

294

19.79

硬脂酸甲酯

298

5.67

3 結論

（1）分別研究了酸熱法、反復凍融法以及超聲波和酶結合法破碎細胞，甲醇-氯仿提取油脂以及乙醚、石油醚索氏抽提法直接提取油脂，將幾種方法相比較，結果表明超聲波和酶結合使用破碎細胞，甲醇-氯仿提取油脂的效果較好；索式抽提法采用石油醚為提取劑效果較好。

（2）對提取的油脂進行了成分的分析，其中棕櫚酸甲酯占25.10%，亞油酸甲酯占20.99%，油酸甲酯占25.17%，硬脂酸甲酯占4.78%，與植物油相似。

參考文獻

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